本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种氯氰菊酯降解菌菌粉的制备方法及其在土壤中的应用。
背景技术：
农作物是人类赖以生存和发展的重要食品，在自然环境中易发生病虫害，常用农药防治，以提高农作物品质和产量。但农药的大量使用使作物、土壤及水源受到不同程度污染，严重威胁环境和食品安全。目前氯氰菊酯以其杀虫谱广、高效、低残留、性质稳定、安全系数高等优点，在防治农业害虫方面具有广泛应用；又因其应用范围广、接触人群多、有蓄积性等，从而引起农残超标、水土污染、人体中毒等现象频发。由于氯氰菊酯理化性质比较稳定，具有耐光、热分解，且残留范围广，传统物理化学方法处理难度大、成本高。与其他方法相比，微生物降解具有降解速度快、操作简单、成本低、无二次污染等优点。
我国耕地自然环境复杂，污染程度差异较大。利用土著微生物，降解速度慢，降解能力不稳定，不能满足实际要求。因此，筛选适应性强，环境友好的降解菌株是解决上述问题的根本方法。研究可进一步丰富广谱性拟除虫菊酯降解菌资源库，为受氯氰菊酯污染农作物生长环境的生物修复及进一步保障其食用安全提供菌株资源和理论基础。
技术实现要素：
本发明的目的是针对上述技术存在的问题，提供一种氯氰菊酯降解菌菌粉的制备方法及其在土壤中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种氯氰菊酯降解菌菌粉的制备方法，将氯氰菊酯降解菌接种至种子培养基，于34～40℃振荡培养12～36h，再转接至发酵培养基在，于34～40℃振荡发酵培养48～72h，置于-20～-80℃冷冻处理1～8h，再于78～85℃水浴处理1～4h，3000～8000rpm离心10～30min，在无菌条件下收集菌泥复溶于0.8～1.5％NaCl溶液中，进行二次离心，3000～5000rpm离心10～30min，随后将得到的二次离心菌泥与冻干保护剂按照1:1～5的重量比混合均匀，-38～-42℃真空冷冻干燥后制成含菌量为0.5～2.5×1011CFU/g的菌粉；所述氯氰菊酯降解菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BBCP-017，于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.12886。
进一步的，所述发酵培养基配方为：胰蛋白胨0.3～1.5％、酵母浸出粉0.3～1.5％、NaCl 0.3～1.5％、MnSO4 0.01～0.25％，蒸馏水1000mL。
进一步的，所述发酵培养基的pH为6.5～7.5。
进一步的，所述冻干保护剂配方为：脱脂奶粉5～20％、葡萄糖0.5％～5％、蒸馏水1000mL。
进一步的，所述冻干保护剂pH为6.3～6.8。
本发明的另一目的是提供一种氯氰菊酯降解菌的菌粉制备方法制备的菌粉。
本发明的另一目的还提供一种氯氰菊酯降解菌的菌粉在降解土壤中氯氰菊酯的应用。
进一步的，将菌粉按质量体积百分比为0.001％～0.005％的比例复溶于无菌水或1～15％脱脂奶粉溶液中，再将菌粉悬液按照体积比1～5:100的比例添加至含氯氰菊酯的土壤中。
本发明的有益技术效果是：
1、本发明筛选氯氰菊酯降解菌的菌粉溶于无菌水后加入含60mg/L氯氰菊酯的土壤中培养7d后，降解率达89.03％；说明本发明的蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉具有环境生物修复的应用价值以及广阔的应用前景，本发明菌粉制备工艺简单易行，适合工业化生产，具有含活菌数量高、保质期长、使用简单、使用量少等优点。
2、菌粉使用方便，操作简单，只需要简单复水或者溶解于1～15％的脱脂奶粉溶液中，就可直接使用，不需要连续扩培繁殖传代，减少不必要的浪费；菌粉应用于田间土壤中能有效降解体系中的氯氰菊酯，是可应用于受氯氰菊酯污染环境的生物修复剂；产品性能稳定，可在4℃以下冷冻保存，保质期长达36月；在室温条件下也可维持18月的发酵活力；同时方便运输，适合长距离配送。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明是氯氰菊酯标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1蜡样芽孢杆菌BBCP-017的分离、纯化
②土样处理：采自长期施用氯氰菊酯的耕地土壤，经自然风干
过80目筛备用。
②降解菌的富集驯化：取1.0g土样加入氯氰菊酯浓度为20mg/L的基础盐培养基，于37℃振荡(180rpm)培养24h后，取5％(v/v)培养液转接至氯氰菊酯浓度为40mg/L的基础盐培养基中，按照上述操作连续转接3次，培养基中氯氰菊酯浓度逐次提高至160mg/L。
③降解菌的筛选纯化：驯化后，将菌液(OD600nm＝1.0)进行梯度稀释涂布转接到氯氰菊酯浓度为40mg/L的固体平板上，37℃培养24h，挑取单菌落于相同的固体平板连续划线纯化三代，挑选出菌落形态规则、生长速度最快的氯氰菊酯降解菌株BBCP-017；并将其保存于种子斜面，备用。
④氯氰菊酯降解菌株BBCP-017经形态、生理、分子鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)；该菌株已于2016年8月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.12886。
⑤上述培养基的配方由以下重量体积比计的组分组成。基础盐培养基：(NH4)2SO40.05～0.25％，KH2PO4 0.05～0.25％，K2HPO4 0.05～0.25％，MgSO4 0.05～0.25％，NaCl 0.05～0.25％，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.5；种子培养基：胰蛋白胨0.5～1.5％，酵母浸出粉0.25～1％，NaCl 0.25～1.5％，蒸馏水1000mL，pH 6.5～7.5；固体培养基同液体培养基加入2.0％的琼脂；121℃灭菌20min。灭菌后在无菌条件下加入一定体积的氯氰菊酯溶液使其为试验所需浓度，混匀备用。
实施例2蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉的制备
①种子液制备：从实施例1中保存的种子斜面中挑取蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌落，接种于50mL种子培养基中，初始pH7.0，37℃振荡(180rpm)培养24h，即为种子液。
②发酵培养：以5％(v/v)的接种量接种至发酵培养基中，锥形瓶装液量为250mL/500mL，初始pH 7.0，37℃振荡(180rpm)培养48h，结束培养。
③集菌体：将发酵培养液于-40℃冷冻处理4h，取出，再于80℃水浴处理2h，制片经孔雀绿染色，镜检观察，芽孢率达95％以上；以4000rpm离心20min，在无菌条件下，去除发酵上清液，收集菌泥复溶于1％NaCl溶液中，4000rpm离心20min，除出上清液，将冻干保护剂与二次离心菌泥按1:1～5的质量比混和均匀，备用。
④真空冷冻干燥：将菌泥混合物于-40℃真空冷冻干燥12h，得到均匀的淡黄色晶体形固体。在无菌密封条件捣碎下制成蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉，置于铝膜袋中，抽真空得成品。
⑤活化计数：取0.100g蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉复溶于100mL无菌水中，共三组平行，在无菌条件下将复溶菌粉悬液连续稀释5次，每次三个重复，使其稀释倍数依次为10、1×102、1×103、1×104、1×105，再分别取0.1mL稀释液于平板中，倾注发酵培养基混匀于37℃倒置培养16h观察菌落生长情况；最终在三组稀释倍数为1×105的平板中平均菌落数依次为52、94、247，即本发明的蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉含菌量为0.5～2.5×1011CFU/g。
⑥冻干保护剂的配方由以下重量体积比计的组分组成：脱脂奶粉5～20％，葡萄糖0.5％～5％，蒸馏水1000mL，pH 6.3～6.8，115℃灭菌20min。
⑦发酵培养基的配方由以下重量体积比计的组分组成：胰蛋白胨0.3～1.5％，酵母浸出粉0.3～1.5％，NaCl 0.3～1.5％，MnSO4 0.01～0.25％，蒸馏水1000mL，pH 6.5～7.5，121℃灭菌20min。
实施例3蜡样芽孢杆菌BBCP-017菌粉在耕地土壤中的应用
①氯氰菊酯的检测及其标准曲线方程建立
高效液相色谱(HPLC)检测：试验为每个处理3个重复，每个重复准确称取5.0g风干土壤，加入5mL乙腈，涡轮振荡器振荡至均匀后，超声波(40kHz、100W)辅助提取60min后加入5mL的乙酸乙酯振荡30s，静止后取5mL上清液，过净化柱(无水硫酸钠∶中性氧化铝∶活性炭＝2∶1∶1)，用10mL乙酸乙酯淋洗净化柱，收集有机相于50℃旋转挥干，1mL乙腈复溶；0.45μm有机滤头过滤，HPLC待测。
检测条件：色谱柱为Inertsil ODS-3(5.0μm，150mm×4.60mm(i.d.))，流动相为乙腈-超纯水(90∶10，v/v)，流速为1.0mL/min，柱温为25±2℃，检测波长为210nm，进样量为10μL。
标准曲线线性方程：配制浓度为10mg/L的氯氰菊酯标准液，上机进样量依次为1、2、5、10、20、50μL，即质量分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5μg；拟合氯氰菊酯质量-峰面积的标准曲线线性方程。
实验中氯氰菊酯降解率计算公式按下式进行：
式中，C为实验组氯氰菊酯残留浓度；C0为对照组中氯氰菊酯残留浓度。
氯氰菊酯标准曲线如图1所示，其线性方程为y＝7447784.2852x+12231.1382，其相关系数R2为0.9998，表明线性关系良好。
②田间试验
试验于2016年3月在成都郫县某农作物耕地进行，土壤作物为油白菜。土壤理化性质经测定为：砂质粘土，土壤pH6.78，有机质27.90g/kg，总氮含量122.30mg/kg，总磷含量138.44mg/kg，总钾含量85.23mg/kg。
在菜园中划分4块面积约为10m2的土壤，均用手动背式喷雾器喷洒氯氰菊酯浓度为10g/L的原药液，均匀喷洒，喷洒量为100mL/m2；同时配制含菌量为1×108CFU/mL的菌粉悬液，选择两块土地作为实验组均匀喷洒菌粉悬液，喷洒量为100mL/m2。每天定时采土样，按5点采样法，用专用取土工具，所采土样为耕层0～20cm，土样混合，混合后的鲜土用四分法留取1kg，装入聚乙烯塑料袋，标记密封；土壤经自然风干后研磨过筛保存，连续7d采用HPLC法测定对照组和实验组的氯氰菊酯残留量。
土壤中氯氰菊酯残留测定结果见表1，实验组土壤中氯氰菊酯残留浓度远远低于对照组，且氯氰菊酯的降解率达89.03％，说明蜡样芽孢杆菌BBCP-017能有效降解耕地土壤中的氯氰菊酯，对耕地土壤能起到生物修复的作用。
表1耕地土壤中氯氰菊酯的残留量变化
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。