玉米花粉发育调控基因Ms33的DNA序列及其编码蛋白的制作方法

本发明涉及一种玉米花粉发育调控基因Ms33及其编码蛋白序列，属于基因工程领域。
背景技术：
：植物的生殖生长是一个非常复杂的过程，从造孢细胞到成熟的生殖细胞要经历数十个发育阶段，任何一个发育阶段出现异常都会造成生殖生长的停滞并导致植物育性的丧失。配子体发育是植物生殖生长中的重要阶段，植物雄配子体的非正常发育会导致无法形成花粉或花粉生育力丧失，这一现象称为雄性不育（MaleSterile）。因此对雄性不育的研究有助于理解复杂的植物生殖生长过程。玉米（ZeamaysL.）是我国重要的禾本科粮食作物，因为其雌雄同株异花的特点而被视作植物生殖生长的理想研究对象。此外，具有雄性不育性的玉米自交系应用于杂交育种和商业化种子生产中，具有不需要人工去雄、种子纯度高等优点，能够大幅降低科研育种和商业化种子生产的成本，提高育种效率。本发明提供了一种控制玉米花粉发育基因的DNA序列、启动子序列及该基因所编码蛋白质的氨基酸序列，该基因的功能缺失会造成玉米的雄花败育，由此可以产生新的雄性不育材料，在科研和农业生产中具有重要的应用价值。技术实现要素：本发明提供一种新的调控玉米花粉发育基因Ms33的DNA序列、cDNA序列、启动子序列和该基因所编码功能蛋白的氨基酸序列，所述基因是一种植物雄穗特异性表达基因，所述基因功能的缺失会特异性导致玉米雄花不育。本发明的第一个发明目的是：提供一种调控玉米花粉发育的新基因Ms33，其特征在于，是选自如下1）或2）或3）的DNA分子。1）SEQIDNO.1所示DNA分子（克隆自玉米自交系B73的基因组DNA）：该DNA分子由2198个核苷酸组成，-119至-1为核苷酸为5’端非翻译区（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸为第一外显子，+706至+836位核苷酸为内含子，+837至+1709位核苷酸为第二外显子，+1710至+2079位核苷酸为3’端非翻译区（3’-UTR）。2）SEQIDNO.2所示的DNA分子（克隆自玉米自交系B73的cDNA）。3）在SEQIDNO.1基础之上经过一至数个碱基替换和\或一至数个碱基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位所形成能够影响植物花粉生育能力的DNA分子。本发明的第二个发明目的是：提供上述基因所编码的调控植物花粉发育的相关蛋白质。在一个实施方案中，所述基因编码如下1）或2）所述的蛋白质。1）序列表的SEQIDNO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。2）将序列表的SEQIDNO.3经过一个或数个氨基酸残基的取代、和/或缺失、和/或添加且具有影响植物花粉发育功能相关活性的蛋白质。本发明的第三个发明目的是：提供在植物雄花器官中调节所述基因序列转录表达的启动子。在一个实施方案中，所述启动子序列如SEQIDNO.4所示DNA序列，该序列具有在植物雄花器官中特异启动如SEQIDNO.1所述基因序列转录的功能。序列表的SEQIDNO.4为所述基因的启动子序列，总长1429个核苷酸对应图6.A所示基因结构-1至-1429位，所述启动子含有第1368bp-1371bp核苷酸的CAAT框（CAATbox）对应图6.A所示基因结构-61至-58，第1371bp-1375bp核苷酸的TATA框（TATAbox）对应图6.A所示基因结构-58至-54，启动子的必要区域包括TATA框和CCAAT框的-54位至-61位，-1至-82区域是特别必要区域。本发明的第四个发明目的是：提供含有所述基因和/或启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。本发明的第五个发明目的是：提供上述基因用于转基因改良作物的用途。在一个具体实施方案中，所述基因用于诱导作物植株雄性不育，以便导入外源基因以获得优质的转基因作物。在另一具体实施方案中，所述作物是自花授粉或异花授粉作物。在一个更加具体的实施方案中，所述作物包括但不限于玉米、大麦、高粱、谷子、水稻。本发明的第六个发明目的是：提供了一种在其它植物中获取Ms33基因的直系同源基因的方法，以及利用该方法获高粱（Sorghumbicolor）、谷子（Setariaitalica）、大麦（Hordeumvulgare）、水稻（Oryzasativa）的氨基酸序列（图10）。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供的玉米花粉发育调控基因Ms33直接参与小孢子时期的发育调控，该基因的表达受到抑制后，小孢子细胞壁发育受到抑制，同时花药表皮细胞发生降解，并最终导致在小孢子发育末期的凋亡和花器官的雄性不育现象。通过植物生物技术途径，本发明在农作物的杂种优势利用和不育化杂交种制种生产中都将发挥重要作用。术语定义术语“调控植物花粉发育的基因”指一段具有编码蛋白能力的核苷酸序列，该序列特异编码具有调控植物花粉发育功能的蛋白活性多肽，如SEQIDNO.2的第83-1660位核苷酸序列及其简并序列。术语“简并序列”是指，位于SEQIDNO.2的编码框第83-1660位核苷酸序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.2的第83-1660位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDNO.2所编码的氨基酸序列。所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括在中度严格条件下，更佳的在高度严格条件下可以与SEQIDNO.2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。其中，中度严格条件可以是0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS（w/v）的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜的条件。所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括与SEQIDNO.2中从第83-1660位核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地具有至少80%、82%、85%、86%、88%、89%同源性，更佳地具有至少90%、91%、92%、93%、94%同源性，最佳地具有至少95%、96%、97%、98%、99%同源性的核苷酸序列。所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括能编码具有与天然的调控玉米花粉发育基因Ms33基因相同功能蛋白的、SEQIDNO.2开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：1个或几个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’-UTR或3’-UTR端添加1至数个核苷酸。所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括能够翻译一类具备调控玉米花粉发育功能的氨基酸序列，如SEQIDNO.3的氨基酸序列。该类氨基酸序列还包括具有与天然调控玉米花粉发育蛋白相同功能的SEQIDNO.3的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：1个或几个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或几个氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。另外，所述的“调控植物花粉发育的基因”的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，然后细胞转化等常规方法从增殖的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入实施例蛋白序列中。除了用重组法产生之外，实施例蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成多肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用人工或自动进行，可以分别化学合成实施例蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的蛋白质分子。附图说明图1为野生型和玉米突变体ms33-6029的小花在抽雄期的形态观察示意图：图A，正常可育植株（WT）的小花和不育突变体（ms33-6029）的雄穗形态比较；图B，正常可育植株（WT）的小花和不育突变体（ms33-6029）的小花形态比较；图C和D，可育株（WT，C）和突变体（ms33-6029，D）的花粉经1%KI-I2染色结果比较。图2为Ms33基因的遗传定位结果：基因被定位在玉米2号染色体（标记EP97和bnlg1893之间）。图3为Ms33基因的物理定位结果：基因被精细定位在一个349Kb的物理区间内（标记EP603和EP605之间），矩形所示为区间内的功能基因，黑色框代表候选基因GRMZM2G070304。图4为分子标记苗期鉴定可育株和纯合不育株的电泳图：利用EP198引物扩增目的条带大小为500bp，隐性纯合体为上带，显性纯合体为下带，杂合体为双带；利用EP605引物扩增目的条带大小为750bp，隐性纯合体为下带，显性纯合体为上带，杂合体为双带。图5为利用引物1和引物2在基因组DNA中扩增的PCR产物，经浓度2%琼脂糖凝胶电泳鉴定不育突变特异的分子量条带（黑色箭头标注为可育基因型和不育基因型的特异扩增条带）：M，DNALadder；1-2，ms33-6029突变体（基因型ms33-6029/ms33-6029）；3-4，野生型（基因型Ms33/Ms33）。图6为野生型与突变体中Ms33的基因结构示意图：A，Ms33基因在野生型B73中的基因结构，由2198个核苷酸组成，-119至-1为核苷酸为5’端非翻译区（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸为第一外显子，+706至+836位核苷酸为内含子，+837至+1709位核苷酸为第二外显子，+1710至+2079位核苷酸为3’端非翻译区（3’-UTR）；B，Ms33基因在突变体ms33-6029中的基因结构示意图，在第一外显子+223与+224位之间插入了一个长度为1368bp的转座子（DTA_ZM00216），使得该突变基因翻译提前终止。图7为Ms33基因预测编码的蛋白质氨基酸序列在野生型B73和突变体ms33-6029的比较结果，红色下划线注为Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)结构域。图8为Ms33基因在B73中的半定量反转录PCR的表达谱分析：EV，早期大液泡小孢子时期雄穗；MV，中期大液泡小孢子时期雄穗；LV，后期大液泡小孢子时期雄穗；Root，根；Stem，茎；Leaf，叶片；Tassel（雄穗）标注的三个泳道代表检测样品来自不同时期雄穗总RNA转录的cDNA。图9为利用半定量RT-PCR对Ms33基因在纯合不育突变体ms33-6029/ms33-6029和纯合可育Ms33/Ms33（WT）植株在不同发育时期雄穗中表达量差异的分析结果：Q，小孢子母细胞减数分裂四分体时期雄穗；EV，早期大液泡小孢子时期雄穗。图10为玉米Ms33基因翻译的氨基酸序列与其在大麦、高粱、谷子、水稻中直系同源基因翻译产物的比较结果，红色下划线标注为保守的Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)结构域。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明的应用范围。下述实施例中的所有技术和科学术语，如无特殊说明，均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。除非有相反指明，本发明所使用或提及的技术均为本领域普通技术人员公认的标准技术。所述试验材料，如无特别注明，均为本发明领域通用的试验材料。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。材料、方法和实施例谨作阐述用，而非加以限制。本发明所述的雄性不育，特指由植物细胞核基因发生功能变化导致植物雄花发育出现异常（无法产生雄花、花药或者正常的雄性配子体）并出现育性的丧失，即通常所说的雄性核不育（Genicmalesterility）而非细胞质核不育（Cytoplasmicmalesterility）。雄花育性的异常和恢复均由细胞核内的基因加以控制。因此，本发明也包括利用序列表所述序列调控植株的雄配子生育能力，即利用本发明提供的基因序列在基因组、和/或转录组、和/或蛋白质组水平影响其它植物中相同或同源基因的功能来达到控制雄花育性的目的。例如，下述方法但不限于下述方法：通过天然序列的变异导致基因表达抑制或蛋白质功能的丧失、通过向植物中转入所述基因的反义序列或引入发卡结构、或将所述基因与其它序列（DNA或RNA）相结合产生新的具有功能活性的DNA或RNA链，来影响或改变植物基因的功能。或其它本领域技术人员已知的可用于影响植物雄花育性的技术方法中的任何一种技术方法。本发明包括玉米Ms33基因，其显性等位基因对植物雄花育性具有关键作用，功能缺失性的隐性等位基因会导致雄性不育。该基因位于玉米2号染色体，其基因具体位置如图2、图3所示。该基因序列及其同源序列可从任何显花植物中获得，包括但不限于玉米（Zeamays）、普通小麦（Triticumaestivum）、高粱（Sorghumbicolor）、水稻（Oryzasativa）、短柄草（Brachypodiumdistachyon）、谷子（Setariaitalica）、大麦（Hordeumvulgare）、黑麦（Secalecereale）、粗山羊草（Aegilopstauschii）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）、甘蓝（Brassicaoleracea）、大豆（Glycinemax）、番茄（Lycopersiconesculintum）等。获得方法包括但不限于：通过玉米Ms33基因序列利用blastx、blastn或通过氨基酸序列利用blastp从其它植物的基因组序列数据库、和/或cDNA序列数据库、和/或蛋白质序列数据库中调取；以Ms33基因的DNA或cDNA或RNA序列为参考序列设计引物，直接从其它植物的基因组DNA或cDNA或RNA中利用PCR的方法直接获得；以玉米Ms33的基因序列设计探针，利用核酸杂交的方法从基因组文库中分离含有同源基因序列的DNA或cDNA或RNA片段。“Ms33基因同源序列”指在与SEQIDNO.3的氨基酸进行blastx比较分析后，Identities大于或等于35%、Positives大于或等于50%，且识别区域位于SEQIDNO.3的314至482位氨基酸即Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)结构域内的植物基因的DNA序列。进行blastx时，所有参数均遵照http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/所示的默认设置进行。下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，但这并非意欲对本发明的范围加以限制。实施例1.Ms33基因突变体的鉴定和基因精细定位雄性不育是由于控制雄花发育的基因发生变异导致雄花败育，通常表现为没有雄花或雄花花药干瘪、花药中没有花粉或只有有少量非正常发育的花粉。与育性正常的植株的雄花相比，ms33-6029突变植株（天然突变体，选自专利权人单位北京首佳利华科技有限公司收集的玉米育种材料）的雄花花药不外露（图1.A），花药严重退化（图1.B），经过1%KI-I2花粉染色，野生型花粉可以正常染色（图1.C），突变体无花粉不能染色（图1.D），从而表明ms33-6029突变体是一个无花粉型雄性不育突变体。以昌7-2为父本、隐性不育突变体ms33-6029为母本，构建了F2分离群体。2013年夏季种植于北京通州育种基地。按上述性状特征对其进行育性调查，选取了228株表现雄性不育表型的单株作为不育基因池，采用集团分离分析法（Bulk-segregantanalysis，BSA）对突变位点进行遗传分析。已有研究表明，ms33位点位于2号染色体长臂（参考文献1-4）。基于maizeGDB（http://www.maizegdb.org/）中标记数据库信息，从40对SSR标记中筛选出5个在ms33-6029与昌7-2间有多态性的SSR分子标记（表1，第1-5行），通过对228株不育单株进行PCR扩增和凝胶电泳分析，检测不育基因与标记的连锁关系。结果显示这5个分子标记在不育基因池中超过60%的单株表现出与不育基因供体ms33-6029一致的基因型（表2），表明这5个标记与ms33位点紧密连锁。表1.基因定位引物序列表。序号引物名称正向序列反向序列1mmc0381GTGGCCCTGTTGATGAGCGACGAGTACCAGGCAT2bnlg1940CCTTTTGTTTCAGGCCGTTACAGCAGCCTGATGATGAACA3umc1230GTACGACCGTTGAAACTGTTGTTTTGCGATTTCAACTATTTGTGGTAAAGG4umc1551CACCGGAACACCTTCTTACAGTTTCGAAACCTTCTCGTGATGAGC5umc2214CTGGATGAGGAGGAAGAATACGAGACCCCCTGATTCTCTCTTACGTTT6umc1252GCGTCGGAGAAGTACATCAAGTTTCTTCTGCATCATCATCATCGTCTT7bnlg1893AATCCTGTAGCGTGTGTCCCTAACTGAGTTGTTGAAGGAAATTG8EP95AACCTAGCAGTGGTCGTTGGGACGTAGTTCTGTCCAGCCC9EP97CGAGATGACGTTGAAACACGTGTGAAAGTTGGCATTGACC10EP198AGCCTCGATTCCTTCATCCGGCAGTAAAGCCACTACAACAGG11EP603GAAGCACTCAATCGAGCCGCATAGAAGCCCTTACACAC12EP605GGCACTCATGGTCAACAACTCGAAATTCAGATTGCAGG13EP480CAACAAAGCTAGGATTCCTCGATACAGCCCCTTGAGGTCCA表2.多态性标记与ms33不育位点的连锁关系分析。标记名称：mmc0381bnlg1940umc1230umc1551umc2214不育基因池ms33-6029基因型比例64.47%66.23%70.18%77.63%60.96%2013年冬季在海南南繁基地种植了F2群体（916株），对其进行育性调查，可育表型和不育表型单株比例为681:235，符合3:1的单基因分离比（χ2=0.087，P=0.7681）。基于表1信息从maizeGDB中调取了mmc0381至umc2214之间的9对多态标记（含umc0381和umc2214，表1第1-9行）对该F2群体单株进行了基因型鉴定，构建了ms33区间的遗传连锁图谱，并根据单株的育性数据初步将ms33定位于EP97与bnlg1893之间11.5cM的区间内（图2）。进一步调取B73基因组序列设计了4对多态标记EP198、EP603、EP605和EP480（表1第10-13行），最终将ms33定位在EP603和EP605之间约349Kb的物理区间内。从MaizeGDB调取B73的基因组序列，在去除假基因和转座子序列后，在该249Kb区间共有15个功能基因（图3），其中一个预测为GPAT家族基因GRMZM2G070304具有与花器官发育相关的功能。有文献报道GPAT基因家族参与花器官的发育和形态建成，因此选取该基因作为Ms33的候选基因进行后续分析。实施例2.Ms33基因在野生型和突变体中的克隆首先，利用Ms33的紧密连锁分子标记EP198和EP605,通过PCR和电泳分析，可以在苗期区分野生型和突变体的基因型（图4）。其次，利用引物1（5’-GGGATAACCTAAAGCAAGGC-3’）和引物2（5’-GCACCGCAGAGATACAATAAAG-3’）可在B73和Ms33位点的隐性突变体ms33-6029中特异克隆GRMZM2G070304基因（图5）。同时用引物3（5’-AGTAGACACCGCCCAATCTC-3’）和引物2在B73的花器官cDNA中扩增全长编码区对上述基因组中的扩增片段进行验证。所有PCR扩增均使用KODFXDNAPolymerase（TOYOBOCO.，LTD.LifeScienceDepartment，Osaka，Japan），并按照产品说明的反应体系和条件，在Bio-radMyCyclerPCR仪进行PCR扩增。PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。经过测序，并且与玉米B73基因组序列信息比对后，发现该基因全长2198bp（SEQIDNO.1），其在玉米基因组内为单拷贝基因。通过野生型B73中的基因组序列（SEQIDNO.1）、cDNA序列（SEQIDNO.2）的比对分析，发现该基因的基因组序列结构特征如下（图6A）：含有2个外显子（Exon）和1个内含子（Intron），-119至-1为核苷酸为5’端非翻译区（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸为第一外显子，+706至+837位核苷酸为内含子，+837至+1709位核苷酸为第二外显子，+1710至+2079位核苷酸为3’端非翻译区（3’-UTR）。此外，对纯合突变体ms33-6029中的Ms33基因测序后，发现Ms33突变基因ms33-6029全长3566bp，通过与MazieTransposableElementDatabase（maizetedb.org/~maize/）进行blastn分析发现，在第一个外显子+223处插入了一个长为1368bp的转座子（DTA_ZM00216），基因翻译在+288处即已经停止（图6B）。实施例3.Ms33基因在野生型B73和突变体ms33-6029中编码蛋白的序列差异在野生型B73中，Ms33基因的蛋白质编码序列长1578bp，通过对该基因cDNA序列（SEQIDNO.2）进行模拟翻译，发现该基因编码一个525个氨基酸的蛋白，将该蛋白序列与GenBankSwissProt蛋白质数据库进行blastx分析，显示该蛋白含有一个Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)保守结构域（第314-482位氨基酸，如图7所示）；在突变体ms33-6029中，由于在Ms33基因序列223位核苷酸的转座子插入（图6B黑色剪头标注处）导致了第75位氨基酸后发生改变，编码蛋白仅含有95个氨基酸，并且使突变体编码的蛋白不再具有任何功能结构域（图7）。这表明Ms33基因在突变体中的序列变异直接导致了翻译氨基酸的序列变化和翻译的提前终止，特别是基因的LPLAT结构域被破坏。Ms33基因的功能缺失型突变体ms33-6029表现雄配子的败育，这证明了具有SEQIDNO.1所述DNA序列的Ms33基因具有控制玉米雄性生育力的功能，当SEQIDNO.1、2所示序列发生一至数个碱基替换和\或一至数个碱基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位导致SEQIDNO.1的序列结构和功能发生变化时，将导致玉米雄性生育力的丧失。实施例4.Ms33基因在B73及突变体中的转录水平分析分别采集B73各个发育时期雄穗，每个完整雄穗取一半经液氮速冻保存，用于提取雄穗小花的总RNA，剩余雄穗的小花在卡诺固定液（酒精：冰乙酸＝3:1）中固定48小时，再经1%醋酸洋红（1g洋红溶于100ml45%醋酸）染色进行细胞遗传学观察，确定准确的发育时期。选取处于减数分裂四分体时期（Quartets，Q）、早期大液泡小孢子期（Early-vacuolatemicrospore，EV）、中期大液泡小孢子期（Mid-vacuolatemicrospore，MV）、晚期大液泡小孢子期（Late-vacuolatemicrosoire，LV）四个雄穗发育时期的B73雄穗的小花总RNA用于Ms33基因的表达谱分析，另外提取B73减数分裂期植株的叶片、茎、根的总RNA，用于分析基因在不同组织中的表达水平。使用实施例1所述紧密连锁标记EP198、EP605在苗期鉴定纯合隐性ms33-6029位点的不育单株和相同遗传背景下携带杂合Ms33/ms33-6029位点的可育植株（图4），用相同方法分别提取不育株和可育植株的减数分裂四分体时期、早期大液泡小孢子期、中期大液泡小孢子期、晚期大液泡小孢子期四个雄穗发育时期的雄穗小花总RNA（所有雄穗均提前经细胞遗传学观察，确定准确的发育时期）。每一个样本均采取半定量反转录PCR（Semi-quantitativeReverseTranscriptionPCR，qRT-PCR）进行Ms33基因的表达量检测。qRT-PCR以ZmActin基因作为内参报告基因，引物4（5’-GCAGAGATGGTGAAGAAGGC-3’）和引物5（5’-ACACCATCGGCTTTGGGTA-3’）用于特异检测Ms33基因和ms33-6029突变基因的表达水平，引物OGF49（5’-GGCCACAAGCTGCTCAACCT-3’）、OGF50（5’-ATGTGGTTGCCCAGGGACTT-3’）用于检测ZmActin基因的表达。RT-PCR中每个样品的Ms33基因和ZmActin基因的PCR反应均设置3个独立重复实验。一、Ms33基因在B73中的表达谱分析Ms33基因是一个雄穗特异表达基因，且仅在特定的生理时期（发育期雄穗）行使功能。qRT-PCR结果显示，除雄穗（主要是早期大液泡小孢子期的雄穗）外，在其它组织中均未检测到Ms33基因的表达（图8）。二、Ms33基因在突变体中的差异表达检测在四分体和早期大液泡小孢子时期，Ms33基因在ms33-6029突变体中的表达明显被抑制，qRT-PCR的结果如图9所示：Ms33基因在纯合不育的ms33-6029植株中的表达均显著低于同时期携带纯合Ms33/Ms33位点的可育植株，ms33-6029突变体中Ms33基因的表达量非常微弱。实施例5.Ms33基因在玉米、高粱、谷子、水稻、大麦中的同源性分析如前文所述，Ms33基因在玉米中特异调控雄穗的配子体发育。当其功能被抑制时将导致玉米雄配子体育性丧失即雄性不育。利用Ms33基因的cDNA序列，通过blastx在genebank获得了该基因在高粱、谷子、水稻、大麦中的直系同源基因（编号分别为：XM_002449936.1、XM_004979921、Os11g45400、AK376456）。如图10所示，Ms33基因在玉米、高粱、谷子、水稻、短柄草的314-482位氨基酸表现出高度保守性，而这一区域正是LPLAT结构域的位置，在314位以前和482位以后的氨基酸变异较大。据此可以判断，Ms33在其它植物中同样存在，并且在关键结构域上保持保守性的特点。即该基因对植物保持正常的雄配子生育力而言具有关键作用，是必不可少的，当基因发生序列变异时会极大地影响植物的雄配子育性。实施例6、Ms33基因的启动子克隆使用引物6（5’-ATACTGTGTGCCTGCTGCCTAC-3’）和引物7（5’-CAAGTTGGTGAGATGGAATAGG-3’）的组合能够从野生型B73中扩增出Ms33基因的上游基因组序列1429bp，该序列如SEQIDNO.4所示。在该序列的第1368-1371位核苷酸具有CAAT框（CAATbox），第1371-1375位核苷酸具有TATA框（TATAbox），具有启动下游基因转录的功能。此外，通过在线顺式调控元件预测工具PlantCARE（网址链接为http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对该启动子序列进行分析，发现除了上述的CAAT框和TATA框外，还具有一系列顺式作用元件，如ABRE（+46位）、ARE（+60位）、CAT-Box（+946位）、CRTCA-box（+1117位）、G-box（+48位）、GAG-box（+199、+439位）、GARE-box（+1109、+853位）、GATA-box（+317、+422位）、GATT-box（+674位）、HSE（+211位）、I-box（+317、+347位）、L-box（+1347位）、MRE（+251位）、O2-site（+344位）、skn-1motif（+1219位）、sp1（+536位）和TGACG-motif（+885位）等，分别响应于逆境、激素、光、热等诱导因素，初步证明该启动子序列可以调控下游基因的转录表达。相关文献1、Beadle，GW(1932)Genesinmaizeforpollensterility.Genetics，17:413-431。2、Albertsen，MCandPhillips，RL(1981)Developmentalcytologyof13geneticmalesterilelociinmaize.CanJGenetCytol，23:195-208。3、李竞雄、周洪生、孙荣锦等（1998）玉米雄性不育生物学，中国农业科学出版社。4、吴锁伟、方才臣、邓联武、万向元（2012）玉米隐性核雄性不育基因研究进展及其育种应用途径分析，分子植物育种(网络版)，10：1001-1011。当前第1页1 2 3