脐带间充质干细胞外泌体的用途的制作方法

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及脐带间充质干细胞外泌体的用途。

背景技术：

外周造血干细胞是存在于外周血中的造血干细胞。1979年Goldman等为一组加速期或急变期慢性粒细胞白血病患者移植初诊时采集冻存的外周血细胞，使患者重新回到慢性期，开始了外周血造血干细胞移植(PBSCT)的临床应用。

正常情况下，外周血中的干/祖细胞的含量占单个核细胞的0.01％～0.1％相当于骨髓的1％～10％，动员后外周血MNC中CD34⁺细胞数及CFU数均明显高于骨髓。迄今已发现多聚阴离子化合物(如硫酸葡聚糖)、糖皮质激素、细菌内毒素、抗肿瘤药物、四氢叶酸以及造血生长因子等均能有效地动员骨髓和其它部位的造血干/祖细胞进入外周血。从而有可能直接从血液中采集到干细胞移植所需要的足量的干细胞。但是细胞动员会对造血干细胞产生损伤，具有较大的副作用。

如果能够实现外周造血干细胞在体外的大量繁殖，则会给干细胞移植提供更多的选择，但目前，造血干细胞体外扩繁的效果并不理想。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供脐带间充质干细胞外泌体的用途，实验表明，脐带间充质干细胞外泌体能够提高外周血造血干细胞的克隆形成能力、促进外周血造血干细胞增殖与增强外周血造血干细胞活力。

本发明提供了脐带间充质干细胞外泌体在提高外周造血干细胞克隆形成能力中的应用。

本发明还提供了脐带间充质干细胞外泌体在促进外周造血干细胞增殖中的应用。

本发明还提供了脐带间充质干细胞外泌体在增强外周造血干细胞活力中 的应用。

外泌体(exosome又叫微小囊泡microvesicles)是由内涵体(endosomal compartment)释放。脐带间充质干细胞(mesenchrymal stem cells,MSCs)的外泌体通过生物合成与内吞作用参与到精确而复杂调控的膜运输过程。现有研究已证明MSCs分泌的外泌体可以减少心肌损伤范围、保护急性肾小管损伤、促进神经再生、减少肺损伤等方面有重要作用。本发明实验表明，相对于采用完全培养基的培养实验而言，采用脐带间充质干细胞外泌体与外周造血干细胞共培养，能够将培养所得的细胞数量提高约1.5倍，克隆形成数量也提高约1.5倍。经统计学分析，与未添加脐带间充质干细胞外泌体的培养效果相比，添加脐带间充质干细胞外泌体的实验效果具有极显著差异(p<0.001)。

本发明还提供了一种外周造血干细胞的培养基，其含有脐带间充质干细胞外泌体。

具体的，本发明提供的培养基中包括：体积分数为30％～35％的脐带间充质干细胞外泌体、体积分数为6％～7％的FBS(胎牛血清)、体积分数为0.6％～0.7％的双抗溶液(青霉素/链霉素)、4ng/mL的IL-3(白介素-3)、6ng/mL～7ng/mL的SCF(干细胞因子)、6ng/mL～7ng/mL的IL-6(白介素-6)；余量为基础培养基。

所述双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml；链霉素的含量为10mg/ml。

一些具体实施例中，本发明提供的培养基中包括：体积分数为33％的脐带间充质干细胞外泌体、体积分数为6.67％的FBS、体积分数为0.67％的双抗溶液、4ng/mL的IL-3、6ng/mL～7ng/mL的SCF、6ng/mL～7ng/mL的IL-6；余量为基础培养基。

本发明中采用的基础培养基为IMDM培养基。

脐带间充质干细胞外泌体的制备方法为：将脐带间充质干细胞的培养上清液依次经过400g离心10min、2000g离心20min和10000g离心30min后，取上清液，经0.22μm孔径滤膜过滤后，100000g离心1h，收取沉淀后以PBS缓冲液重悬，再次100000g离心1h，所得沉淀以PBS缓冲液重悬，制得脐带间充质干细胞外泌体。

每120mL脐带间充质干细胞的培养上清液制得的外泌体以2mLPBS缓冲液重悬。

脐带间充质干细胞的培养上清液的制备方法为：将P3～P5代MSCs在37℃、5％CO₂培养条件下使用无血清培养基培养48小时，收集培养上清液。

所述无血清培养基为Lonza间充质干细胞无血清培养基(批号：0000543297)；MSCs的接种密度为1X10⁵/mL。

本发明还提供了一种外周造血干细胞的培养方法，以本发明提供的培养基培养外周造血干细胞。

外周造血干细胞的获得可为市场购得也可为自行分离或通过其他合法途径获得。

外周造血干细胞的分离方法包括如下步骤：梯度离心法分离外周血中骨髓单核细胞。将所得的单核细胞重悬于IMDM完全培养基(IMDM+10％FBS+1％双抗溶液+6ng/ml IL-3+10ng/ml SCF+10ng/ml IL-6)中，密度为1×10⁶cell/mL，培养24h后，将所得的外周血单核细胞用磁珠分选的方法分离CD34⁺造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)。

磁珠分选的具体方法为：将培养的外周血单核细胞每10⁷cell重悬于80μL磁珠分离缓冲液中，加入20μLCD34⁺磁珠，混合均匀，4℃孵育15分钟。孵育后用用缓冲液清洗多余的抗体，将孵育后的细胞通过磁性分离柱分离，得到CD34⁺造血干细胞。

培养中，外周造血干细胞的接种密度为1×10⁶cell/well。

培养的温度为37℃，饱和湿度，5％CO₂。

本发明提供了脐带间充质干细胞外泌体的用途，含有脐带间充质干细胞外泌体的培养基及外周造血干细胞的培养方法。本发明实验表明，相对于采用完全培养基的培养实验而言，采用脐带间充质干细胞外泌体与外周造血干细胞共培养，能够将培养所得的细胞数量提高约1.5倍，克隆形成数量也提高约1.5倍，。经统计学分析，与未添加脐带间充质干细胞外泌体的培养效果相比，添加脐带间充质干细胞外泌体的实验效果具有极显著差异(p<0.001)。

附图说明

图1示扫描电镜检测外泌体；

图2示外泌体纳米粒度分析；

图3示HSCs细胞数量；

图4示HSCs体外克隆；其中图4-a示实验组HSCs体外克隆；图4-b示对照组HSCs体外克隆；

图5示HSCs体外克隆数量；

图3或图5中***示组间存在极显著差异，p<0.001。

具体实施方式

本发明提供了脐带间充质干细胞外泌体的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1脐带MSCs外泌体的提取分离

将生长良好的P3～P5代MSCs在37℃、5％CO₂培养条件下使用无血清培养基(Lonza间充质干细胞无血清培养基)培养48小时,收集120mL细胞培养上清液。采用超高速离心法，依次经过400g离心10min、2000g离心20min和10,000g离心30min，得到不含细胞、细胞碎片及其他颗粒物的上清液。上清液经过0.22μm孔径的滤膜过滤，然后通过超高速100,000g离心1h，弃上清留沉淀物。用10mlPBS重悬洗涤沉淀物，再次100,000g离心1h，弃上清得沉淀物即外泌体。外泌体提取的离心过程都在4℃进行，提取的外泌体用适量(2mL)PBS重悬后-80℃保存备用。

获得外泌体的鉴定：

①电镜观察细胞形态

取20μL外泌体悬液滴于载样铜网光面上，室温条件下静置1分钟，用滤纸从一侧吸干液体，滴加20g/L的磷钨酸约20μL于载样铜网上，室温负染1分钟后滤纸吸干负染液，于白炽灯下烘烤约10分钟，透射电镜下观察并拍照保存(图1所示)。

通过扫描电镜检测和纳米粒度分析仪进行验证，可见经过超高速提取的胶状沉淀呈球形囊泡状，其直径主要在30～120nm之间(图2所示)，符合外 泌体的形态特征。

②流式细胞术检测外泌体表面标志

将分离纯化后的MSCs来源的外泌体与PE标记的鼠抗人CD9、CD63抗体室温避光孵育30分钟，用PBS洗涤1遍后，用1％的多聚甲醛重悬，上流式细胞仪检测分析。结果显示，分离纯化后的MSCs来源的外泌体表达CD9及CD63，符合外泌体特性。

实施例2人外周血造血干细胞分离与纯化：

外周血约5mL,按密度梯度离心法分离骨髓单核细胞。具体方法如下：将采集的骨髓样本加入等量PBS上，缓慢加入，4℃离心，2000rpm离心30分钟。吸取中间呈乳白色中间层，此层即为富含单核细胞的层。将所得的单核细胞重悬于IMDM完全培养基(IMDM+10％FBS+1％PS+6ng/ml IL-3+10ng/ml SCF+10ng/ml IL-6)中，吹打均匀，进行细胞计数。将细胞以1x10⁶/mL的密度接种于100mm的培养皿中，放置于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养24h。

将培养所得的外周血单核细胞用磁珠分选的方法分离CD34⁺造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)。具体方法如下：将分离的外周血单核细胞每10⁷重悬于80μL磁珠分离缓冲液中，加入20μLCD34⁺磁珠，混合均匀，4℃孵育15分钟。孵育后用用缓冲液清洗多余的抗体，将孵育后的细胞通过磁性分离柱分离，得到CD34⁺造血干细胞。

实施例3

实验组：

实施例2制得的HSCs以1×10⁶cell/mL密度接种于24孔板中培养基1mL(IMDM+10％FBS+1％PS+6ng/ml IL-3+10ng/ml SCF+10ng/ml IL-6)，加入0.5mL脐带MSCs外泌体，培养基与外泌体体积比为2:1，置于5％CO₂培养箱37℃培养，3天后以1:1的体积比与0.4％的台盼蓝混合均匀，置于显微镜下观察并计数，根据染色情况计算细胞活力。

培养后的细胞以6×10³的密度接种于0.3mL IMDM完全培养基中，转移至Methocult^TM H4531培养基中，混匀后室温静置5分钟。将1.1mL细胞及 培养基混悬液转移至35mm细胞培养皿中，置于5％CO₂培养箱37℃培养，7天后观察克隆形成能力，并在光学显微镜下拍照计数。

对照组：

以不添加外泌体的细胞为对照，具体为实施例2制得的HSCs以1×10⁶cell/mL密度接种于24孔板中培养基1mL(IMDM+10％FBS+1％PS+6ng/ml IL-3+10ng/ml SCF+10ng/ml IL-6)，培养6天后，以1:1的体积比与0.4％的台盼蓝混合均匀，置于显微镜下观察并计数，根据染色情况计算细胞活力。

培养后的细胞以6×10³的密度接种于0.3mL IMDM完全培养基中，转移至Methocult^TM H4531培养基中，混匀后室温静置5分钟。将1.1mL细胞及培养基混悬液转移至35mm细胞培养皿中，置于5％CO₂培养箱37℃培养，7天后观察克隆形成能力，并在光学显微镜下拍照计数。

细胞计数结果如图3，根据图3，添加外泌体能够使细胞数量提高1.5倍左右，与对照相比，该效果具有极显著差异(p<0.001)。

细胞克隆形成情况如图4-a(实验组)和图4-b(对照组)，克隆数统计结果如图5，结果显示，添加外泌体能够极显著的提高细胞克隆形成能力(p<0.001)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。