从结缔组织分离的蛋白质粗萃物及其方法与用途与流程

本发明属于蛋白质领域，更具体地，涉及一种从结缔组织分离的蛋白质粗萃物及其方法与用途。

背景技术：

胶原蛋白是动物体内非常重要的蛋白质，是细胞外空间的重要的结构蛋白；胶原蛋白也是结缔组织的主成分，也存在于肌腱、韧带、皮肤、眼睛角膜等组织，约占动物体总蛋白质量的20％～30％。

胶原蛋白是由三股独立的胶原蛋白肽链、透过肽链上甘氨酸形成氢键，形成并维持三股螺旋互相缠绕的结构，称为原胶原。数个原胶原横向堆积后，相互间会发生羟醛缩合反应而产生共价连接，成为胶原微纤维；数个胶原微纤维再经过相似的反应而产生共价键合，形成胶原纤维，而胶原纤维便是胶原蛋白进行生理作用的基本型态。

胶原蛋白分为五种型，第一型胶原蛋白主要存在于皮肤、肌腱、器官及骨骼中；第二型胶原蛋白主要存在于软骨中；第三型胶原蛋白为网纹纤维蛋白(reticulin)的主要成分；第四型胶原蛋白主要构成基底膜粘连蛋白(basallaminin)，存在于上皮组织的基底膜中(basementmembrane)；第五型胶原蛋白存在于细胞表面、头发或胎盘中。

胶原蛋白具有极高的经济价值，可以广泛应用在医药或美容用途，例如可作为干细胞(stemcell)培养系统的支撑材料以帮助干细胞生长、含药型心血管支架上包覆药物的材料、烧烫伤病人伤口的敷料、胶原蛋白止血棉片、胶原蛋白膜骨填料、保湿抗老化妆品、口服营养补充品等等；目前市面上所见到的胶原蛋白商品，原料大多都是使用第一型胶原蛋白。

目前胶原蛋白的来源主要是从动物组织萃取得到，市场上常见的胶原蛋白可萃取自猪皮、牛皮、鱼皮、鱼鳞等等，例如台湾专利申请twi487711便是以鲔鱼鱼皮为原料进行胶原蛋白的萃取。但源自动物的胶原蛋白可能会引起过敏反应，例如对海鲜过敏的人可能就不适合使用萃取自鱼皮/鱼鳞的胶原蛋白产品。为了降低胶原蛋白导致的过敏现象，美国专利申请us20120284817a1便利用基因工程的方法，以转基因植物合成人类胶原蛋白，但由于植物与哺乳类动物的酶系统并不完全相同，产生的胶原蛋白翻译后修饰(posttranslationalmodification)的状态仍与一般源自哺乳类的胶原蛋白不同。

另外，中国专利申请cn101812457a公开了采用大肠杆菌来表达人类胶原蛋白片段。然而，细菌表达产生的致热原致使表达产物难以应用于临床，目的蛋白通常以包涵体形式表达，致使产物纯化困难，另外原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。为了克服细菌表达体系具有内毒素、致热原的安全问题，越来越多的研究者开始利用真核微生物来表达重组类人胶原蛋白，例如，中国专利cn102020716a公开了采用酵母细胞来表达重组类人胶原蛋白。然而，利用真核细胞表达的人胶原蛋白仍然存在纯化困难、纯度不高以及蛋白降解的问题。此外，这些利用真核细胞表达的胶原蛋白的氨基酸序列与人体不完全相同，在生物安全性和生物相容性方面也存在缺陷。

技术实现要素：

鉴于上述现有的以转基因生物制备胶原蛋白在实际实施使用时仍具有多种缺陷，发明人对其加以改善，并据此研究得到本发明。

本发明提供了一种从结缔组织分离的蛋白质粗萃物，所述蛋白质粗萃物包括：(i)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述蛋白质粗萃物中，其中，所述蛋白质粗萃物包括：(i)seqidno:1的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)seqidno:1的氨基酸序列、seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述蛋白质粗萃物中，其中，所述蛋白质粗萃物被抗人胶原蛋白抗体特异性识别。

在上述蛋白质粗萃物中，其中，所述蛋白质粗萃物从非人类结缔组织分离得到。

在上述蛋白质粗萃物中，其中，所述蛋白质粗萃物从转基因大鼠的结缔组织分离得到，所述转基因大鼠的基因组dna具有编码人类第一型胶原蛋白的脱氧核醣核酸序列。

在上述蛋白质粗萃物中，其中，所述编码人类第一型胶原蛋白的脱氧核醣核酸序列为seqidno:4或seqidno:5。

本发明还提供了一种制备含目标氨基酸序列的蛋白质粗萃物的方法，包括：(a)构建含有seqidno:4或seqidno:5的脱氧核醣核酸序列构成物；(b)将所述脱氧核醣核酸序列构成物转入动物胚胎，再将所述动物胚胎移殖到同品系母性动物中，使所述动物胚胎发育成成年动物；(c)从所述成年动物的结缔组织分离出含有目标氨基酸序列的蛋白质粗萃物，其中，所述目标氨基酸序列为：(i)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述方法中，其中，所述目标氨基酸序列为：(i)seqidno:1的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)seqidno:1的氨基酸序列、seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述方法中，其中，所述动物为大鼠。

在上述方法中，其中，所述蛋白质粗萃物被抗人胶原蛋白抗体特异性识别。

本发明还提供了一种具有目标氨基酸序列的蛋白质粗萃物在用于制备人类第一型胶原蛋白中的用途，其中，所述目标氨基酸序列为：(i)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述用途中，其中，所述目标氨基酸序列为：(i)seqidno:1的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(ii)seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；或(iii)seqidno:1的氨基酸序列、seqidno:2的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列。

在上述用途中，其中，所述蛋白质粗萃物被抗人胶原蛋白抗体特异性识别。

在上述用途中，其中，所述蛋白质粗萃物从转基因大鼠的结缔组织分离得到，所述转基因大鼠的基因组dna具有编码人类第一型胶原蛋白的脱氧核醣核酸序列。

在上述用途中，其中，所述编码人类第一型胶原蛋白的脱氧核醣核酸序列为seqidno:4或seqidno:5。

在上述用途中，其中，所述人类第一型胶原蛋白应用于医药材料、美妆保养品、食品添加剂中。

在上述用途中，其中，所述医药材料包括胶原蛋白止血棉、手术缝合线、伤口敷料、骨填充物、人工血管和软组织填充剂。

在上述用途中，其中，所述美妆保养品的形式为水剂、乳剂、膏剂、粉剂、美白剂、淡斑剂、袪斑剂或上述任意的组合。

在上述用途中，其中，所述美妆保养品包括胶原蛋白保湿液、胶原蛋白保湿霜和胶原蛋白面膜。

在上述用途中，其中，所述食品添加剂添加于骨骼关节保健食品和抗衰老保健食品。

附图说明

图1示出了转基因鼠的配种策略一。

图2示出了转基因鼠的配种策略二。

图3示出了转基因鼠与野生型大鼠的尾粗萃物。

图4示出了尾粗萃物的蛋白质分析结果(a)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，(b)蛋白质免疫印迹法。

图5示出了通过蛋白质免疫印迹法检测尾粗萃物大鼠乙型肌动蛋白的表达。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明提供了一种从非人类结缔组织分离的蛋白质粗萃物，其包括(i)与seqidno:1具有91％以上相似度的的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列、(ii)与seqidno:2具有93％以上相似度的的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列或(iii)与seqidno:1具有91％以上相似度的的氨基酸序列、与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列；其中该蛋白质粗萃物可被抗人类胶原蛋白抗体特异性识别，且由转基因大鼠的结缔组织分离得到，此转基因大鼠的基因组dna具有编码人类第一型胶原蛋白的脱氧核醣核酸序列，此编码人类第一型胶原蛋白的脱氧核醣核酸序列为seqidno:4或seqidno:5。

本发明也提供一种含目标氨基酸序列的蛋白质粗萃物的制备方法，包含(a)构建含有如seqidno:4或seqidno:5的脱氧核醣核酸序列构成物(dnaconstruct)；(b)分别将脱氧核醣核酸序列构成物引入一大鼠胚胎，再将大鼠胚胎移殖到同品系母鼠中使其发育成鼠；(c)由成鼠的结缔组织分离出一含有目标氨基酸序列的蛋白质粗萃物，其中目标氨基酸序列为选自(i)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列、(ii)与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列或(iii)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列，且制备的蛋白质粗萃物可被抗人类胶原蛋白抗体特异性识别。

举例而言，蛋白质粗萃物所包含的目标氨基酸包含有(i)seqidno:1及seqidno:3的氨基酸序列、(ii)seqidno:2及seqidno:3的氨基酸序列或(iii)seqidno:1、seqidno:2及seqidno:3的氨基酸序列。

本发明也提供一种具有目标氨基酸序列的蛋白质粗萃物用于制备人类第一型胶原蛋白的用途，其中目标氨基酸序列为选自(i)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列、(ii)与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列或(iii)与seqidno:1具有91％以上相似度的氨基酸序列、与seqidno:2具有93％以上相似度的氨基酸序列及seqidno:3的氨基酸序列，且蛋白质粗萃物被抗人类胶原蛋白抗体特异性识别；蛋白质粗萃物由转基因大鼠的结缔组织分离得到，且转基因大鼠的基因组dna具有编码人类第一型胶原蛋白的脱氧核醣核酸序列seqidno:4或seqidno:5。

此外，藉由下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用的范围，但不意欲以任何形式限制本发明的范围。

简言之，本发明揭露一种源自外源性胶原蛋白转基因大鼠、含有外源性胶原蛋白粗萃物与大鼠乙型肌动蛋白粗萃物的混合物，且揭示其制备方法与用途；外源性胶原蛋白基因可为人、兔、牛或猪的胶原蛋白基因；而兔、牛或猪的胶原蛋白col1a1氨基酸序列与人类胶原蛋白col1a1氨基酸序列具有91％以上的相似度；兔、牛或猪的胶原蛋白col1a2氨基酸序列与人类胶原蛋白col1a2氨基酸序列具有93％以上的相似度；以下为人类胶原蛋白转基因鼠的实施例：

实验一、制备人类胶原蛋白转基因鼠

本实验利用特异性佳的crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/cas9)基因编辑方法，将人类第一型胶原蛋白基因hcola1或hcola2转入sd大鼠(sprague-dawleyrat)，使大鼠的结缔组织表达人类第一型胶原蛋白。其流程如下：

(一)制备sgrna(singleguiderna)、cas9表达rna、col1a1或

col1a2标定载体

合成具有识别大鼠胶原蛋白基因col1a1或cal1a2的寡核苷酸(oligodna)，以制备sgrna(singleguiderna)，序列分别为seqidno:8～seqidno:15；将成对的oligodna进行退火(annealing)反应，条件如下：95℃作用3分钟、95℃作用30秒、95℃至85℃降温(降温速度：每分钟下降2℃)、85℃至25℃降温(降温速度：每秒钟下降0.1℃)、降温至4℃。

以限制性内切酶(restrictionenzyme)切割质粒puc57-t7-sgrna，得到线性(linear)双链核酸，并将此线性双链核酸与上述退火(annealing)所得的产物以核酸连接酶(ligase)接合，以得到重组质粒(recombinantplasmid)；将此质粒转入大肠杆菌(escherichiacoli)，由于重组质粒上带有特殊抗生素基因，故可利用抗生素挑选出带有重组质粒的菌株、放大培养该菌株以扩增(amplify)上述重组质粒。将重组质粒以限制性内切酶切割，得到线性重组质粒。另取cas9蛋白质表达质粒(cas9expressingplasmid)，以限制性内切酶切割，得到线性cas9蛋白质表达质粒。将线性重组质粒与线性cas9蛋白质表达质粒进行体外逆转录并浓缩纯化，以获得用以显微注射的sgrna与cas9rna。

以大鼠基因组dna(genomicdna)、人cdna(源自人类口腔黏膜细胞)、大鼠cdna、与含有flagtag/bghpa的质粒及cole1_amp+minimal载体为模板，使用引物seqidno:16～seqidno:27进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)与gibsonassembly，得到的标定重组载体cole1_amp+minimalvector_r/hcol1a1targetconstruct携带嵌合基因seqidno:6。

使用引物seqidno:28～seqidno:39，以大鼠基因组dna(genomicdna)、人cdna(源自人类口腔黏膜细胞)、大鼠cdna、含有hatag/bghpa的质粒及cole1_amp+minimal载体为模板，进行聚合酶链式反应(pcr)及gibsonassembly，得到的标定重组载体cole1_amp+minimalvector_r/hcol1a2targetconstruct携带嵌合基因seqidno:7。

(二)动物原核胚显微注射(pronuclearmicroinjection)或胚原核电穿孔

转基因(electroporation)

准备一受精第0.5天的合子(zygote)，以原核显微注射法(pronuclearmicroinjection)或原核电穿孔转基因法(electroporation)，将(一)所制备的产物，以sgrna10ng、cas9mrna50ng与col1a1(或col1a2)标定载体4ng混合后，一起转入合子中，以获得受精0.5天的转基因合子。

将性成熟(满七周)未怀孕且发情的雌鼠，与结扎公鼠交配，使其进入假孕状态(pseudopregnant)，交配后隔天检查母鼠阴道，有栓塞(plug)情形的母鼠定义为0.5天假孕雌鼠。将20-30颗转基因合子注射入0.5天假孕雌鼠的输卵管中，让转基因合子可在雌鼠体内生长分化。转基因小鼠将于17-21日后出生，且出生后约三周可离乳，转基因小鼠离乳后将取其尾部组织，抽取dna，进行基因型分析(genotyping)，以初步选出转基因成功的始代鼠(f0)。hcol1a1转基因鼠的基因型分析以引物seqidno:40～seqidno:43进行，且hcol1a2转基因鼠的基因型分析以引物seqidno:44～seqidno:47进行；上述基因型分析为公知技术，在此不再赘述。

实验二、转基因鼠配种方法(策略一、二)

为获得具有同型人类胶原蛋白转基因的大鼠(homologousstrain)，使用两种配种策略以获得所需的转基因动物，请参照图1，为配种策略一，叙述如下：以hcol1a1转基因鼠为例，实验一所得的f0鼠只有一个基因组上的基因被置换(heterologousstrain)，基因型以h1r1/r2r2表示(h:human，r:rat，1:col1a1基因，2:col1a2基因)；为获得两基因组都被置换的动物(homologousstrain)，进行以下配种流程：将f0(h1r1/r2r2)与野生型大鼠(wildtype，r1r1/r2r2)配种；f0(h1r1/r2r2xwt(r1r1/r2r2)，得到初代鼠，基因型可能为f1(h1r1/r2r2)或f1(r1r1/r2r2)；将f1(h1r1/r2r2)进行自我配种[f1(h1r1/r2r2)xf1(h1r1/r2r2)]，可获得子代f2(h1h1/r2r2)、f2(h1r1/r2r2)与f2(r1r1/r2r2)，挑出子代f2(h1h1/r2r2)进行后续配种；胶原蛋白基因col1a2转基因鼠的配种方式同上，最终挑出子代f2(r1r1/h2h2)进行后续配种。

将col1a1转基因鼠的f2(h1h1/r1r1)与col1a2转基因鼠的f2(r1r1/h2h2)配种，获得f3(h1r1/h2r2)；将f3(h1r1/h2r2)进行自我配种，并挑出子代f4(h1h1/h2h2)，以f4(h1h1/h2h2)进行自我配种[f4(h1h1/h2h2)xf4(h1h1/h2h2)]得到的转基因鼠，便会是col1a1以及col1a2皆被置换的转基因鼠。以上转基因鼠的基因型皆以基因型分析(genotyping)而获得，使用的引物为seqidno:40～seqidno:43(hcol1a1转入)与seqidno:44～seqidno:47(hcol1a2转入)。

获得同型人类胶原蛋白转基因大鼠(homologousstrain)的配种策略二请参见图2，叙述如下：以hcol1a1转基因鼠为例，将实验一所得的f0(h1r1/r2r2)鼠与野生型大鼠(wildtype，r1r1/r2r2)配种：f0(h1r1/r2r2)xwt(r1r1/r2r2)，得到初代鼠f1(h1r1/r2r2)或f1(r1r1/r2r2)；胶原蛋白基因col1a2转基因鼠的配种方式同上，获得f1(r1r1/h2r2)或f1(r1r1/r2r2)的子代。

取hcol1a1转基因初代鼠f1(h1r1/r2r2)与hcol1a2转基因初代鼠f1(r1r1/h2r2)进行交配，可能获得基因型为f2(h1r1/h2r2)、f2(h1r1/r2r2)、f2(r1r1/h2r2)与f2(r1r1/r2r2)的子代；以f2(h1r1/h2r2)进行交互配种[f2(h1r1/h2r2)xf2(h1r1/h2r2)]，并挑出子代f3(h1h1/h2h2)；再将f3(h1h1/h2h2)进行交互配种，[f3(h1h1/h2h2)xf3(h1h1/h2h2)]得到的转基因鼠，便可以获得子代的col1a1以及col1a2皆被置换的转基因鼠。以上转基因鼠的基因型皆以基因型分析(genotyping)而获得，使用的引物为seqidno:40～seqidno:43(hcol1a1转入)与seqidno:44～seqidno:47(hcol1a2转入)。

实验三、大鼠尾部粗萃物的制备

大鼠胶原蛋白的粗萃物，可从大鼠尾巴或皮肤萃取得到，以下是以尾巴为材料，进行萃取并分析的结果：将大鼠牺牲后，自根部剪下其尾巴，保存于-80℃，转基因鼠的尾巴与野生型大鼠的尾巴在外观上无明显差异(结果未显示)；将尾巴置于冰上解冻至少30分钟，移除上皮组织、将尾巴粗略切割为六等分，并移除骨头与肌肉；将肌腱剪碎并浸泡于水中，以1倍pbs(1xphosphate-bufferedsaline)缓冲液清洗后，以70％乙醇浸泡10分钟；移除非肌腱组织(如血管或肌肉)，将肌腱组织以离心方式沉降，移除70％的乙醇，获得肌腱初始产物。

将肌腱初始产物称重，并加入1n醋酸溶液(肌腱初始产物重量与1n醋酸溶液体积比介于1:99～1:9，其中较佳为1:9)，持续搅拌，于4℃中作用12～48小时；之后，将肌腱初始产物溶液于-80℃处理12小时，最后于-10℃下执行冻干过程，作用48小时，以去除醋酸与水分，最终获得如图3所示的海绵状冻干粗萃物(即本申请的粗萃物)，此粗萃物将进行进一步分析。

实验四、聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)与蛋白质免疫印迹法(western’sblotting)

将粗萃物应含有10％蔗糖的0.1m乳酸溶液溶解成浓度为1mg/ml的溶液，并取5μg粗萃物，以公知的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及蛋白质免疫印迹法进行分析，简述如下：

进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativepage)，使蛋白质在凝胶中分离，再以含有考马斯亮蓝(coomassieblue)染料的溶液染色2小时、再以脱色液(destainingsolution)清洗24小时；如图4的(a)所示，第1～3栏的样本为转基因鼠尾巴粗萃物，第4～6栏为野生型大鼠尾巴粗萃物，经电泳后，两种大鼠尾粗萃物呈现的模式不同，但可初步推知转基因鼠尾粗萃物中含有大量的某种蛋白质，且此蛋白质不存在于野生型大鼠尾粗萃物中。

为进一步确认以非变性凝胶电泳测得的蛋白质是什么蛋白质，再以蛋白质免疫印迹法分析粗萃物：进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativepage)后，将蛋白质转至nc膜(nitrocellulosemembrane)上，并以特异性识别人类第一型胶原蛋白的抗体(millipore抗体，编号mab3391)识别。如图4的(b)所示，第1～3栏为转基因鼠尾巴粗萃物，人类第一型胶原蛋白抗体作用后会呈现信号，且信号模式与图4的(a)可互相对应，确认转基因鼠尾巴粗萃物中含有大量人类第一型胶原蛋白；然而，图4中的(b)的第4～6栏，以人类第一型胶原蛋白抗体作用后完全没有任何信号，确认野生型大鼠尾巴粗萃物并不含有人类第一型胶原蛋白。

此外，将大鼠尾巴的粗萃物以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sdspage)分离后，使用蛋白质免疫印迹法检测大鼠乙型肌动蛋白(β-actin)的表达情形，如图5所示，不论是转基因鼠或是野生型大鼠，其粗萃物中皆含有大鼠乙型肌动蛋白(β-actin)。

本申请所获得的粗萃物可再继续使用胃蛋白酶(pepsin)或是中性蛋白酶(dispase)处理，以纯化出人类胶原蛋白，以进一步应用于使用胶原蛋白为原料的产品中。

在本申请的一实施例中，由粗萃物纯化的人类胶原蛋白可应用于医药材料中，例如胶原蛋白止血棉、可吸收的手术缝合线、伤口敷料、骨填补物、人工血管、软组织填充剂(softtissuefiller)等等。

在本申请的一实施例中，由粗萃物纯化的人类胶原蛋白可应用于美妆保养品中，其形式包括但不限于水剂、乳剂、膏剂、粉剂、美白剂、淡斑剂、袪斑剂或上述任意的组合，例如胶原蛋白保湿液、胶原蛋白保湿霜、胶原蛋白面膜等等。

在本申请的一实施例中，由粗萃物纯化的人类胶原蛋白应用于食品添加物时，可例如添加于骨骼关节保健、抗衰老保健等营养保健食品。

由上述的实施说明可知，本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本申请的粗萃物能进一步纯化以获得人类第一型胶原蛋白，应用于医材或美容用途上，可降低对非人类胶原蛋白过敏的发生率。

2.本申请的粗萃物源自转基因大鼠，其蛋白质的翻译后修饰(post-translationalmodification)更近似人类第一型胶原蛋白的天然状态。

3.本申请的粗萃物源自于实验动物，其养殖环境受到严密监控，可以降低原料中含有感染性物质的疑虑，并提供质量优良的胶原蛋白来源。

综上所述，本发明的一种从非人类结缔组织分离的蛋白质粗萃物及其方法与用途，的确能凭借上述所揭露的实施例，达到所预期的使用功效。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。