一种过氧化氢荧光探针化合物的制备与应用的制作方法

技术领域

本发明涉及一种过氧化氢荧光探针化合物及其制备与应用，属于荧光探针技术领域。

技术背景

过氧化氢是人体内活性氧物种中的一种，通过氧气的代谢及酶的催化而产生。适量的过氧化氢对免疫细胞的活化，细胞的生长和增殖具有促进作用，然而过量的过氧化氢可能会造成许多严重的疾病，例如，阿兹海默症，帕金森症，心脑血管疾病以及癌症等等。因此，识别以及实时监测细胞内过氧化氢的含量具有十分重要的意义。

目前，作为生物体内过氧化氢的检测方法主要有电化学方法、元素分析以及质谱等方法，这些方法的样品准备过程复杂，检测过程对样品的损伤较大，而且不能进行实时的监测。与之对比，作为一种价格低廉的检测手段，荧光探针检测法由于其不仅具有灵敏度高、选择性好、响应速度快、能够进行实时可视化检测等优点，而且可在生物医学成像方面进行进一步的应用，近几年来备受研究人员的关注。

在现有的荧光探针技术中，过氧化氢探针的种类较少，选择性低，检测不够灵敏等问题。比如DCFH是检测体内ROS的探针，但它容易被空气中的氧气氧化，容易对过氧化氢的检测产生干扰，降低灵敏度。另外，由于过氧化氢存在时间短，易与其它物质反应生成新的活性氧物种，因此对过氧化氢的检测本身就存在一定的难度，设计一种响应时间短，灵敏度高，选择性强的探针具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种反应型过氧化氢荧光探针化合物，既可以检测水中的过氧化氢，还可以在生物体内识别和检测过氧化氢，而且还可应用于深层组织成像。

本发明还提供所述反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种反应型过氧化氢荧光探针化合物，具有式I所示的结构：

。

本发明所述的过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：

1）将2,4-二羟基苯甲醛和环己烯酮，以咪唑为催化剂，四氢呋喃和水为溶剂，在氮气保护下室温反应，得到化合物II；

（2）上步制得的化合物II溶于丙酮中，加入4-硼酯溴苄，以无水碳酸钾为催化剂，在50℃下搅拌过夜反应，得到化合物I；

根据本发明，优选的，步骤（1）所述2,4-二羟基苯甲醛、环己烯酮的摩尔比为1:1.1；

根据本发明，优选的，步骤（2）所述II、4-硼酯溴苄的摩尔比为1:1.1；

根据本发明，优选的，步骤（1）、（2）全程在氮气保护下进行；

根据本发明，优选的，步骤（1）反应温度为25℃；

根据本发明，优选的，步骤（2）反应温度为50℃；

更为详细的，所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，步骤如下：

(a) 取2,4-二羟基苯甲醛1.106g，咪唑0.816g置于三口烧瓶中，氮气保护，取1.3毫升环己烯酮加入烧瓶中；另取四氢呋喃6毫升，水6毫升加入烧瓶中，25℃下反应72小时，然后加入20毫升1M稀盐酸，水相用乙酸乙酯萃取，蒸发溶剂，用体积比为1:6的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂为展开剂，柱层析分离，得到纯产物 II 0.46克。

(b) 将II 0.066g，4-硼酯溴苄0.1g，无水碳酸钾0.06g 加入到10mL丙酮中，50℃下回流过夜，旋干制样，柱层析分离，用体积比为1:6的乙酸乙酯与正己烷的混合溶剂为展开剂，柱层析分离，得产物I 0.107g。

本发明所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的应用，可用于测试细胞、组织和水中的过氧化氢含量。

进一步优选的，所述荧光探针用于在pH=7.4的乙醇和水体积比1:19的溶液中过氧化氢的快速检测。在5%乙醇溶液中最低可探测的过氧化氢浓度为1.46*10^-7 mol/L。

本发明通过实验验证，所述荧光探针在pH=7.4的乙醇和水体积比1:19的溶液中，用波长444nm的光作为激发波长，可以发现其没有荧光，加入过氧化氢十五分钟后检测，溶液在511nm处荧光迅速增强，而其他活性氧物种加入后溶液的荧光没有明显变化，该探针对过氧化氢具有很高的选择性。

将本发明的荧光探针化合物加入含有5%乙醇的水溶液中，配成荧光探针化合物浓度为10微摩尔每升的溶液，用PBS缓冲溶液调节至pH=7.4，加入不同浓度的过氧化氢，用波长444nm的光激发，在波长511nm处的荧光依次增强。得出工作曲线如图3所示，通过测定待测样品的荧光强度，就可以定量的计算出过氧化氢的浓度。

本发明所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物不仅可以用于水中过氧化氢的检测，还可以应用于组织细胞内过氧化氢的检测和成像。

将MCF-7细胞在含有10%牛胚胎血清的1毫升细胞培养基培养12小时，然后用100微摩尔每升的过氧化氢溶液处理10分钟，再用10微摩尔每升的本发明的荧光探针孵育30分钟。细胞用激发波长为444nm的光源激发，在共聚焦显微镜下成像

与现有的检测技术相比，本发明的荧光探针设计新颖，选择性好，且具有良好的水溶性，而不具有生物毒性，在制备方面，均使用常用试剂，合成步骤简单。本发明的优良效果如下：

1、本发明的荧光探针化合物具有较好的水溶性、生物相容性以及较好的膜穿透性，可用于细胞内过氧化氢的探测及成像。

2、本发明的荧光探针化合物由于能用于水体中的定量过氧化氢检测且检测限较低；

3、本发明的荧光探针化合物具有良好的灵敏度和选择性，测试样品前处理简单；

4、本发明的荧光探针化合物为固体粉末，便于储存使用，并且合成方法简单、收率高、成本低、具有良好的推广前景；

5、与现有的技术相比，本发明的荧光探针的选择性高，灵敏度高，检测限低，并且在细胞成像研究对组织细胞几乎无损伤。

附图说明

图1为本发明荧光探针的分子结构示意图。

图2为本发明实施例1荧光离子探针在含有5%乙醇的水溶液中(pH=7.4)，与不同活性氧物种作用后的荧光强度的柱状图。

图3为本发明的荧光探针与不同浓度的过氧化氢的荧光强度工作曲线图。

图4本发明的荧光探针的细胞成像图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。实施例中的各种原料均来自于市场购买。

实施例1、探针I的合成

（a）取2,4-二羟基苯甲醛1.106g，咪唑0.816g置于三口烧瓶中，氮气保护，取1.3毫升环己烯酮加入烧瓶中；另取四氢呋喃6毫升，水6毫升加入烧瓶中，25℃下反应72小时，然后加入20毫升1M稀盐酸，水相用乙酸乙酯萃取，蒸发溶剂，用体积比为1:6的乙酸乙酯和正己烷的混合溶剂为展开剂，柱层析分离，得到纯产物 II 0.46克。核磁氢谱：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm : 1.17-1.20 (t, 6H), 3.38-3.43 (q, J= 14.4,6.8 Hz，4H), 5.14 (s, 2H),

6.04 (s, 1H), 6.31-6.34 (dd, J = 9.2, 2.0 Hz, 1H), 7.34-7.36(d, J = 8 Hz, 2H), 7.54-7.56(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.74-7.76(d, J = 9.2 Hz, 1H), 10.23 (s, 1H)；

(b)取II 0.066g，4-硼酯溴苄0.1g，无水碳酸钾0.06g于10mL丙酮中，50℃下回流过夜，旋干制样，柱层析分离，用体积比为1：3的乙酸乙酯/正己烷的混合溶剂为展开剂，柱层析分离得产物I 0.107g。结构如图1所示。核磁氢谱：¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ ppm : 10.27 (s, 1H), 7.84-7.86 (d, J = 8 Hz, 2H),7.74-7.76(d, J = 9.2 Hz, 1H) 7.46-7.48 (d, J = 8 Hz, 1H), 6.29-6.31 (dd, J = 9.2, 2 Hz 1H), 6.05-6.06 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.36-3.41 (q, J = 14, 7.2 Hz, 4H),1.372(s, 12H), 1.16-1.37(t, 6H)。

实施例2、荧光实验

取实施例1制备的荧光探针化合物，溶解到含有5%乙醇的水溶液中，用PBS缓冲溶液调节pH=7.4；得荧光探针溶液，备用。

（1）、取荧光探针溶液，分12组，每组10毫升，其中1组不加活性氧物种，11组分别加入含有CH₃COOOH, GSH, H₂O₂, HOCl, O₂•-, •OH , otBU, TBHP, Vc溶液，使得每组溶液中含有探针化合物的浓度为10μΜ，活性氧物种浓度为200μM，使得活性氧物种与探针化合物的摩尔比为20:1；采用激发波长为444nm，荧光光度计测试其荧光强度，结果如图2所示：本发明探针溶液本身没有荧光，一旦加入过氧化氢，溶液在511nm荧光迅速增强，而其他离子加入后溶液的荧光没有变化，说明该探针对过氧化氢具有很高的选择性。

（2）、取荧光探针溶液，分15组，每组10毫升，分别加入不同浓度的过氧化氢溶液，调节到溶液中含有探针化合物的浓度为10μM，过氧化氢的浓度分别为探针化合物浓度的0、1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12、13.5、15、16.5、18、19.5、21倍。采用激发波长为444nm，荧光光度计测试其荧光强度，结果如图3所示：溶液在511nm荧光迅速增强，其荧光强度与浓度成线性关系。根据测试计算，本探针化合物的最低检测限为1.46×10^-7 mol/L。

实施例3、细胞成像实验

将MCF-7细胞在含有10%牛胎儿血清的1毫升细胞培养基培养12小时，然后用100微摩尔每升的过氧化氢处理10分钟，在用10微摩尔每升的本发明的荧光探针处理30分钟。细胞用激发波长为437nm的光源激发，在共聚焦显微镜下成像，如图4所示。