具有抗胃溃疡的党参均一多糖及制备方法和应用与流程

本发明涉及中药活性成分的制备方法，具体为具有抗胃溃疡作用的党参均一多糖的分离纯化方法及其抗胃溃疡作用。

背景技术：

党参（Radix Codonopsis）为桔梗科党参属植物，具有补中益气、健脾益肺的功效，临床用于脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消咳等症。党参主要含有多糖、皂苷、三萜、生物碱等成分，其中多糖含量最大，为党参的重要成分之一。现代药理研究表明，党参多糖在抗衰老、调节机体免疫力、抗缺氧、抗应激、抗氧化等多个方面具有较好的生物活性。

但是，文献报道的药理研究大多都针对党参总多糖，目前对组成均一、结构明确的党参多糖的药理活性及其机制研究几乎没有相关报道。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题是通过对党参多糖按分子量进行分级，然后进行药效学活性筛选，得到一种具有组成均一的抗胃溃疡的活性多糖。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种具有抗胃溃疡的党参均一多糖，结构通式如图6所示。

该多糖分子量为3000，是β-D-呋喃果糖残基以β-(2→1)-糖苷键连接而成的直链均一多糖。

上述具有抗胃溃疡的党参均一多糖的分离提取方法，包括如下步骤：

（1）、提取党参总多糖；

根据前期获得的专利（200710062520.5），提取党参总多糖。

（2）、党参多糖的超滤分离

将党参总多糖用蒸馏水稀释10～30倍，水浴加热至20℃～90℃充分溶解，于10℃以下静置12～72小时，浓缩至1～3g/mL，以60%～95%的乙醇醇沉，静置4～24小时，离心，沉淀干燥；重复上述操作1-3次；党参总多糖溶液先后通过1-10万分子量的滤膜及1000-10000分子量滤膜，得到党参均一多糖，记作CPS-A。

党参多糖CPS-A的结构鉴定如下：

对本发明获得的党参多糖CPS-A采用高效凝胶渗透色谱法进行纯度及分子量测定：

色谱条件：Shodex OHpak SB-804色谱柱，流动相为超纯水，流速0.3mL/min，检测器为示差折光检测器；将党参多糖CPS-A用适量水溶解，然后进样分析，分析结果呈单一对称峰，说明该组分为分子量均一的多糖（如见图1所示）。

对本发明获得的党参多糖CPS-A进行结构测定：

CPS-A经纯度鉴别，证明已是单一组成，可以进行结构分析。

CPS-A经完全水解，气相色谱-质谱联用分析，可知其为果糖，以¹H和¹³CNMR进一步分析。

上述分析证明：CPS-A分子量为3000，是β-D-呋喃果糖残基以β-(2→1)-糖苷键连接而成的直链均一多糖。

党参均一多糖在治疗胃溃疡药物中的应用，下述药效学实验证实CPS-A具有抗胃溃疡的药理活性。

本发明中党参多糖CP-A对乙醇诱导的急性胃溃疡大鼠的抑制作用如下：

将SD大鼠随机分为6组，每组10只大鼠：空白组，模型组，党参多糖高、中、低剂量组，阳性对照（枸橼酸铋钾）组。空白组按照10mL/kg灌胃生理盐水，模型组灌胃蒸馏水10mL/kg，党参多糖高、中、低剂量组按照党参多糖0.8g/kg、0.4g/kg、0.2g/kg灌胃。阳性药物组按照枸橼酸铋钾100mg/kg灌胃。每日1次，连续7天后，动物禁食不禁水24小时，第8天开始给药前禁水。给药3小时后，除空白组外，各组均给1mL 70%乙醇灌胃。空白组给1mL蒸馏水。造模1小时以后，腹腔注射戊巴比妥钠45mg/kg麻醉大鼠，5分钟以后腹主动脉抽血处死动物。取出胃，沿胃大弯剪开胃壁，观察胃黏膜，进行胃溃疡指数的测定，计算胃黏膜损伤指数，然后一半胃组织放入10%中性福尔马林溶液中固定，一半制备10%组织匀浆，用于检测胃组织中MPO、SOD、GSH-Px活性和MDA、NO含量。所有数据均用±s表示，多组间数据差异的显著性检验采用单因素方差分析。

结果如图7、图8、表1和表2。

图7表明正常组大鼠胃黏膜光滑平整，没有出血现象。模型组大鼠胃黏膜有严重条索状出血损伤，CPS-A高剂量组和中剂量组出血较少。

图8表明光镜下A（正常组）胃黏膜细胞排列整齐，致密，规则，未见细胞坏死脱落等异常，损伤程度0级（按照Lacy法进行胃黏膜损伤程度分级）。B（模型组）胃黏膜细胞广泛坏死脱落，细胞核固缩，细胞质裂解，细胞排列紊乱，间质疏松，损伤侵及黏膜细胞下层，损伤程度III级。C（CPS-A高剂量组）胃黏膜表层细胞排列不规则,黏膜下层细胞排列整齐，损伤程度I级。D（CPS-A中剂量组）胃黏膜细胞广泛坏死脱落，但是未损伤至腺体。损伤程度II级。E（CPS-A低剂量组）胃黏膜细胞层变薄，细胞排列疏松并且广泛坏死脱落，细胞核固缩，细胞质裂解，损伤侵及腺体，损伤程度III级。F（阳性药物枸橼酸铋钾组）胃黏膜细胞基本正常，黏膜上层细胞排列疏松不规则，细胞核固缩，未延伸至下层细胞，损伤程度I级。

表1 CPS-A对乙醇诱导大鼠胃溃疡胃组织氧化应激的影响

表1表明CPS-A能够不同程度提高大鼠胃组织中SOD和GSH-Px活性，降低MPO活性和NO、MDA含量。并且大鼠胃组织GSH-Px活性随着CPSa剂量的增加而增加，MDA含量随着CPSa剂量的增加而减小，MPO活性随着CPSa剂量的增大而减小。

表2 大鼠胃溃疡指数及溃疡抑制率（±s）

表2表明枸橼酸铋钾组、CPS-A高剂量和中剂量组能够显著降低大鼠胃溃疡指数（按照Guth法进行胃溃疡指数测定）。

附图说明

图1表示 CPS-A分子量分布图。

图2表示CPS-A的气相色谱与标准单糖对照图。

图3表示CPS-A的红外色谱图。

图4表示CPS-A核磁共振¹H-NMR谱图。

图5表示CPS-A的¹³C-NMR谱图。

图6表示CPS-A的结构式。

图7表示CPS-A对乙醇诱导大鼠胃溃疡胃组织形态的影响，其中，A表示正常组，B表示模型组，C表示党参CPS-A高剂量组（50mg/kg），D表示党参CPS-A中剂量组（25mg/kg），E表示党参CPS-A低剂量组（12.5mg/kg），F表示阳性药物枸橼酸铋钾组（100mg/kg）。

图8表示CPS-A对乙醇诱导大鼠胃溃疡胃组织切片光镜结果（10×10），其中，A表示正常组，B表示模型组，C表示党参CPS-A高剂量组（50mg/kg），D表示党参CPS-A中剂量组（25mg/kg），E表示党参CPS-A低剂量组（12.5mg/kg），F表示阳性药物枸橼酸铋钾组（100mg/kg）。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施例进行详细说明。

实施例1

党参多糖CPS-A的制备，包括如下步骤：

取党参总多糖100g，加2000mL蒸馏水，80℃溶解1小时，期间不断搅拌。4℃静置12小时，离心。上清液浓缩至100mL，90%乙醇醇沉，4℃静置12小时，离心。沉淀干燥后，重复之前的操作，得到多糖沉淀，以3000mL蒸馏水，80℃溶解1小时，期间不断搅拌，4℃静置12小时，离心，上清液依次以100000分子量膜、5000分子量膜超滤，压力为1.5个大气压，将最后通过5000分子量膜的滤液浓缩，干燥，得36.45g CPS-A。

实施例2

党参多糖CPS-A的制备，包括如下步骤：

取党参总多糖100g，加3000mL蒸馏水，85℃溶解1.5小时，期间不断搅拌。4℃静置24小时，离心。上清液浓缩至100mL，95%乙醇醇沉，4℃静置24小时，离心。沉淀干燥后，重复之前的操作，得到多糖沉淀，以4000mL蒸馏水，85℃溶解1.5小时，期间不断搅拌，4℃静置24小时，离心，上清液依次以100000分子量膜、5000分子量膜超滤，压力为2.0个大气压，将最后通过5000分子量膜的滤液浓缩，干燥，得40.30g CPS-A。

实施例3

党参多糖CPS-A的制备，包括如下步骤：

取党参总多糖100g，加2500mL蒸馏水，85℃溶解1小时，期间不断搅拌。4℃静置24小时，离心。上清液浓缩至100mL，95%乙醇醇沉，4℃静置24小时，离心。沉淀干燥后，重复之前的操作，得到多糖沉淀，以3500mL蒸馏水，85℃溶解1小时，期间不断搅拌，4℃静置24小时，离心，上清液依次以100000分子量膜、5000分子量膜超滤，压力为2.5个大气压，将最后通过5000分子量膜的滤液浓缩，干燥，得41.50g CPS-A。

本实施例的党参多糖CPS-A的结构鉴定如下：

1、糖组分分解及气相色谱分析

取30mg CPS-A，放入具塞试管，加入2mol/L的三氟乙酸2mL，封管，100℃水解12h，取出后N₂吹干，备用。采用糖腈乙酰法制备衍生物：分别称取标准单糖和多糖样品水解后的糖样各10mg，加入盐酸羟胺10mg，内标肌醇7mg，吡啶0.5mL，于90℃水浴加热30min并振荡，取出冷却至室温，加入醋酸酐0.5mL，在85℃继续加热30min进行乙酰化，产物浓缩至干，加入0.5mL氯仿溶解，溶液经0.45滤膜过滤后，0.2μL进样，气相色谱仪进行分析。结果如图2所示，与标准单糖比较，CPS-A水解产物对应于果糖。

2、红外吸收光谱

样品采用KBr压片法测定，结果如图3所示，从IR图中CPS-A呈现典型的多糖的特征吸收峰，在波数840cm^-1处无吸收，说明不含α-糖苷键，而含β-糖苷键。

3、核磁共振光谱

¹H及¹³CNMR谱的分析

样品溶于D₂O中，常温下测定，结果见图4和图5。参照文献数据，CPS-A的¹³CNMR谱信号与β-D-吡喃果糖多糖的C信号相似，结合文献苷化位移规律，可知CPS-A中的果糖以-β（1, 2）-键连接。对各信号归属如下：62.0 （C-1），103.4 （C-2），77.0 （C-3），74.5 （C-4），81.5 （C-5），60.8 （C-6）。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖权利要求保护范围中。