本发明属于环境污染生物修复领域，涉及一种酰胺类除草剂乙草胺降解菌及其菌剂的发酵生产和应用。
背景技术：
乙草胺是美国孟山都公司1971年开发的一种新型酰胺类除草剂，作为该类除草剂早期开发的品种，乙草胺占酰胺类除草剂当前销售量的最大份额，是目前世界上最重要的除草剂品种之一，也是目前我国使用量仅次于草甘膦的第二大类除草剂。可广泛用于玉米、水稻、花生、棉花、大豆、烟草、蔬菜等农作物的芽前土壤处理。因其具有除草活性高、持效期适中、应用范围大等优点，所以应用面积不断扩大。
随着乙草胺的大量使用，其对环境的危害也日益加大，主要表现为对土壤微生物的影响、对土壤动物的毒害、对哺乳动物的毒害和对人类健康的影响、对鱼类和水生动物的毒害以及对植物的毒害。鉴于此，美国环境保护局1994年将乙草胺定为B-2类致癌物质，但目前，乙草胺在我国旱田化学除草剂中仍占有着相当重要的地位，是我国生产量和使用量最多的三大除草剂之一，2011年，乙草胺在我国的使用量达7.3万吨。
由于环境中残留的乙草胺会对环境产生不利影响，因此因而寻求环境友好、生态安全的乙草胺残留消除技术显得十分重要，且一直是农业科技工作者的重要努力方向之一。 微生物修复技术是一种环境友好型的污染治理技术，其原理是利用微生物的新陈代谢活动来降解有机污染物，通过人工接种高效降解性微生物或刺激降解性微生物大量生长，使之能够在自然条件下将有机污染物消除。该项技术起初主要集中在石油污染环境的生物修复研究上，现在，已被应用到土壤、水体等环境中的其他污染物处理。相对于物理、化学修复方法而言，生物修复具有成本低、效果好、无二次污染等优点，因此，该项技术日益引起人们的研究兴趣，在国内外，微生物修复技术已经广泛应用于石油、化工和农药残留有机污染的清除。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种对于氯代乙酰胺类除草剂乙草胺具有较好降解效果的降解菌株，以及通过该降解菌生产的菌剂。利用微生物修复的方法，降解环境中的化学农药残留，消除土壤中的乙草胺残留有机污染，实现绿色无公害农产品的生产。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现。一种乙草胺除草剂的降解菌，芽孢杆菌（Bacillus sp.）ATC-4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO ：12860。
所述的保藏编号为CGMCC NO ：12860的芽孢杆菌ATC-4菌株在降解氯代乙酰胺类除草剂乙草胺中的应用。
所述的保藏编号为CGMCC NO：12860的芽孢杆菌ATC-4菌株在修复土壤或水体环境中乙草胺污染的应用。
一种用乙草胺除草剂的降解菌生产的菌剂，其活性成分为芽孢杆菌ATC-4，通过试管斜面种-摇瓶种-种子罐-生产罐-产品的生产工艺流程，所产生的产品包装剂型为液体菌剂，其生产的具体步骤为：
1）斜面种制备：将芽孢杆菌ATC-4原种在LB固体培养基上活化，验证其降解性能后接种于LB固体试管斜面上备用；
2）摇瓶种制备：将斜面种接种于盛有肉汤培养基的摇瓶中，经30℃恒温振荡培养至对数生长期，准备接种于种子罐；
3）种子罐培养：在500 L种子罐中加入400 L发酵培养基，将发酵培养基经115℃-121℃高压湿热灭菌，待罐体冷却至35℃以下后，将培养好的上述摇瓶种按10%的体积比接种量接种入种子罐，培养至对数生长期；
4）生产罐培养：在生产罐中加入发酵培养基，并经115℃-121℃高压湿热灭菌，待生产罐罐体冷却至35℃以下后通入无菌空气，使罐体保持无菌状态，将培养至对数期的种子液按10%的体积比接种量接入生产罐进行培养；
5）在所述步骤3）种子罐培养和所述步骤4）生产罐培养的过程中，无菌空气的通气量体积比为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240 rpm，培养温度为30℃，全流程培养时间为84-96小时；
6）菌剂产品：生产罐发酵结束后ATC-4菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出罐，直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型，完成发酵菌剂生产。
所述LB固体培养基的成分为：酵母膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH值为7.0，且添加2%的琼脂粉。
所述肉汤培养基的成分为：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH值为7.0-7.2。
所述发酵培养基，其成分为：葡萄糖0.8%，(NH4)2SO4 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO40.05%，NaCl 0.01%，CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，其余成分为水，pH值为7.0-7.3。
所述保藏编号为CGMCC NO ：12860的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ATC-4微生物菌剂在降解氯代乙酰胺类除草剂乙草胺中的应用。
所述保藏编号为CGMCC NO ：12860的芽孢杆菌ATC-4微生物菌剂在修复土壤或水体环境中乙草胺污染中的应用。
一种高效降解除草剂乙草胺的细菌菌株ATC-4，该菌株革兰氏染色呈阳性，经鉴定属于芽孢杆菌（Bacillus.sp），已于2016年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：12860。本发明的ATC-4菌体为杆状，在LB 固体培养基平板上生长2天后，菌落呈淡黄色，圆形，不透明，较干燥，边缘不规则。菌株对接触酶和氧化酶阳性，可以水解淀粉和明胶，VP实验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐实验呈阳性，吲哚实验阴性。
本发明提供的降解乙草胺的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ATC-4（CGMCC NO：12860），该菌株制备的菌剂可在短时间内，使基础盐培养基中的乙草胺降解85%以上，使土壤中乙草胺的残留量降低80％以上，具有广泛的应用潜力和价值。使用该发明生产的乙草胺残留降解菌剂可以利用通用发酵设备进行生产，具有生产使用成本较低、使用方便、去除乙草胺效果优良等特点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地区大面积推广使用，治理土壤和水体环境中乙草胺残留造成的污染。本发明对于保护生态环境，降低除草剂对农作物药害，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明生物材料保藏信息：
本发明的芽孢杆菌（Bacillus sp.）ATC-4是本发明的发明人从安徽长期生产乙草胺的农药厂污泥中筛选获得的纯培养物，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，（CGMCC NO：12860），地址为中国北京，中科院微生物所，保藏编号为CGMCC NO ：12860，保藏日期为2016年8月18日。
实施例1：乙草胺降解菌株的分离和鉴定：
用来富集乙草胺降解菌株的富集基质取自安徽富田农化有限公司农药废水生化处理池的活性污泥，取活性污泥5.0 g 加入100ml 基础盐培养基中（NaCl 1.0 g/L，NH4NO3 1.0 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH7.0，121℃灭菌25 min，固体培养基加2%琼脂。），加入100 mg/L 的乙草胺，30℃，180 rpm 培养7天，以5%的接种量转接到相同的培养基中，连续转接3次，梯度稀释富集液，取10-5-10-7 稀释度的富集液各0.1 mL涂布于加有100 mg/L乙草胺的固体培养基平板上，30℃培养4天后，挑取长出的单菌落接种于含100 mg/L乙草胺的培养基中，30℃，180 rpm 摇床培养7天，验证其降解效果。
降解效果的验证方法：在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置10 min，待样品分层后，用尖嘴吸管吸弃上清液，底部有机相过无水硫酸钠柱，取1.0 mL置于微量离心管中，室温下氮气吹干；加入1 mL色谱纯甲醇溶解，经孔径0.22 μm滤器过滤后，采用高效液相色谱（HPLC）测定提取液中乙草胺的含量，液相色谱条件：流动相为甲醇：水(80 ：20，V/V)，Zorbax C218 ODSSpherex 反相柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，Agilent，USA)，柱温为室温，紫外检测器，测定波长230 nm，进样量20 μL，流速为1 mL/min。外标法按峰面积定量。
从富集液中，分离到1 株乙草胺降解菌，命名为ATC-4。菌株ATC-4在固体培养基上生长3天后，菌落呈淡黄色，圆形，不透明，较干燥，边缘不规则。G+，菌体为短杆状，大小为0.5-1.0×1.0-1.5 μm。好氧生长，对接触酶和氧化酶阳性，可以水解淀粉和明胶，VP实验、硝酸盐还原实验、柠檬酸盐实验呈阳性，吲哚实验阴性。菌株ATC-4 的形态和生理生化特征和Bergey′ s manual of systematic bacteriology 上对芽孢杆菌菌属的描述一致。
以菌株ATC-4的基因组DNA 为模板，用细菌16S rRNA 基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度为1419 bp 的16S rRNA 基因序列（Genbank 登录号为KX524426.1）。在RDP 数据库(https://rdp.cme.msu.edu/)中进行Blast，结果表明菌株ATC-4与芽孢杆菌属（Bacillus）菌株的同源性最近，结合生理生化特征将该菌鉴定为芽孢杆菌属。将该菌株送交位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏编号为CGMCC NO ：12860，保藏日期为2016年8月18日。
降解菌剂的发酵制备：
将本发明的乙草胺降解菌ATC-4原种在LB固体培养基（成分如下：酵母膏 5.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0，固体培养基添加2%的琼脂粉）平板上活化，验证其降解性能后接种于LB 固体试管斜面上备用。将斜面种接种于含200 mL肉汤培养基（成分如下：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0-7.2）的1 L摇瓶中，30℃恒温振荡培养至对数生长期，准备接种于种子罐。在500 L种子罐中加入400 L发酵培养基，其成分如下：葡萄糖0.8%，(NH4)2SO4 1%，K2HPO4 0.2%，MgSO4 0.05%，NaCl 0.01%，CaCO3 0.3%，酵母膏0.02%，其余成分为水，pH值7.0-7.3。将培养基121℃高压湿热灭菌，待罐体冷却至35℃以下后，将上述培养好的摇瓶种按10%（体积比）的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220 rpm，无菌空气通入量为1:0.8。在生产罐（5吨）中加入4.5吨发酵培养基，培养基成分与种子罐中的培养基一样，投料后的生产罐121℃高压湿热灭菌，待罐体冷却至至35℃以下后通入无菌空气，使罐体保持无菌状态备用。将培养至对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐进行培养，培养温度控制在30℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2（体积比），搅拌速度为240 rpm，全流程培养时间为84-96小时，发酵结束后ATC-4菌体数量达到10亿个/mL以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
本发明的应用案例1：
培养基中ATC-4对氯代乙酰胺类除草剂生物降解实验：
在基础盐培养基（同实施例1）中加入终浓度为100 mg/L 的乙草胺，3％的接种量接入ATC-4菌液，设接种灭活的ATC-4对照，30℃恒温培养箱中培养。定时取样检测菌株对乙草胺的降解情况，结果见表1。菌株ATC-4在3 天内对乙草胺的降解率达到67.8%，7 天内对100 mg/L乙草胺的降解率到85.9％。
表1：菌株ATC-4在培养基中对乙草胺降解效果
本发明的应用案例2：
菌株ATC-4在土壤中对乙草胺的降解试验：
采供试土壤采自菜园土，为从未使用过乙草胺的表层土壤(0~30 cm)，土壤经过风干过筛(Φ=2 mm)后备用。土壤基本理化性质如下：土壤为红壤，pH 6.5，有机质13.23 g/kg，全氮0.85 g/kg，速效氮72.71 mg/kg，速效磷12.54 mg/kg，速效钾126.53 mg/kg。取一定量的乙草胺乳油溶于100 mL 甲醇中，然后将其均匀拌入500 g 土壤中，使土壤中乙草胺的终浓度均为100 mg/kg。新鲜的ATC-4培养液10000 rpm 离心5min 后，收集菌体，用无菌去离子水洗涤3 次后再用无菌水重悬，调节菌体浓度约为1.0×109 cfu/mL，以10%的接种量接入到上述土壤中。于30℃恒温培养箱中培养，不接菌的作为对照，期间土壤的持水量保持在60%。每隔7天，利用液相色谱测定土壤中乙草胺残留量。测定结果如表2。
表2：菌株ATC-4 在土壤中对乙草胺的降解情况
从表2 可以得出，菌株ATC-4在7天内对乙草胺的降解率达到55.8％，28天内对乙草胺和的降解率达到87.9％。
序列表：
<110> 江西省农业科学院农业应用微生物研究所
<120> 一种乙草胺除草剂的降解菌及其菌剂的生产和应用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> Bacillus sp.
<400> 1
aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca 60
cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg 120
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