一种多环芳烃降解菌及其应用的制作方法

文档序号:12248464阅读:563来源:国知局
一种多环芳烃降解菌及其应用的制作方法与工艺

本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种多环芳烃降解菌及其在多环芳烃降解中的应用。



背景技术:

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,简称PAHs)是一类典型的持久性有机物,具有高毒性、难降解等特点。PAHs广泛分布在大气、土壤、水体、沉积物以及植物等各种环境介质中。PAHs的天然源主要来自于地质的成岩作用、森林和草原火灾、火山爆发以及陆生和水生植物、微生物旳合成作用等,人为来源主要包括化石燃料和生物质的不完全燃烧以及化石燃料自然挥发或泄漏等过程。国外对多环芳烃的污染已经展开大量研究,我国局部地区也对此环境科学领域的热点进行初步研究。

PAHs污染环境的主要修复方法包括物理修复法、化学修复法、焚烧法及生物修复法。物理修复法、化学修复法及焚烧法均具有处理速度快、治理成本高、对污染体系破坏性大等特点,仅适用于高浓度点源污染的快速处理。生物修复法成本低、可进行原位修复、对环境破坏小、适用于低浓度、大面积污染点的治理,成为目前多环芳烃污染修复的主要方法。

高分子量的高环PAHs相比低分子量的低环PAHs具有更复杂的化学结构、在水环境中的溶解度更低的特点。目前已报道的多环芳烃降解菌中大部分菌株能够利用低环PAHs(萘、菲)作为唯一碳源生长,对4环以下的多环芳烃具有一定的转化能力,只有少数的菌株能够降解4环及4环以上的多环芳烃。因此,通过筛选4环及4环以上的多环芳烃降解菌对环境介质中存在的高环多环芳烃进行生物法修复PAHs污染的环境介质具有重要意义。



技术实现要素:

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷,提供一种多环芳烃降解菌及其在多环芳烃降解中的应用。

本发明的目的可通过以下的技术措施来实现:

一种多环芳烃降解菌,与现有技术相比,其不同之处在于,所述降解菌为红球菌(Rhodococcus sp.),属于革兰氏阳性菌,所述降解菌的保藏号为CCTCC【M 2016517】。

优选地,所述降解菌的基因序列为SEQ ID No.1。

优选地,所述多环芳烃为四环或四环以上的多环芳烃。

优选地,所述多环芳烃为荧蒽。

本发明还提供了一种细菌制备物,与现有技术相比,其不同之处在于,所述细菌制备物为保藏号为CCTCC【M 2016517】的多环芳烃降解菌的的无机盐培养基。

优选地,所述多环芳烃为荧蒽,所述无机盐培养基的组成如下:0.9gKH2PO4、6.5g Na2HPO4·12H2O、0.4g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O及1mL微量元素溶液,补蒸馏水至1000mL;所述微量元素溶液为:1g FeSO4·7H2O、1g MnSO4·H2O、0.25g Na2MoO4·2H2O、0.1g H3BO4、0.25g CuCl2·2H2O、0.25g ZnCl2、0.1g NH4·VO3、0.25g Co(NO3)2·6H2O、和0.1g NiSO4·6H2O溶于900mL蒸馏水中,再加入5mL浓H2SO4,最后补蒸馏水至1000mL。

本发明另外提供了一种降解多环芳烃的方法,包括使多环芳烃与上述的多环芳烃降解菌、或上述的细菌制备物接触的步骤。

优选地,所述多环芳烃为荧蒽,所述荧蒽的浓度为50-300mg/L,降解的温度为30℃,降解的pH值为7。

本发明还提供了上述的多环芳烃降解菌、或上述的细菌制备物在去除或降解多环芳烃中的用途。

本发明还提供了上述的多环芳烃降解菌、或上述的细菌制备物在处理含有多环芳烃的工业废水或在多环芳烃污染的土壤/水体的生物修复中的用途。

与现有技术相比,本发明的有益效果在于,本申请的申请人意外筛选出一株能够降解多环芳烃的降解菌红球菌YE-WL-2菌株,且发现该菌株属于革兰氏阳性菌,相对于现有技术中的革兰氏阴性菌更加有利于开发和应用。

本发明所发现的多环芳烃降解菌能够高效降解多环芳烃,如蒽、菲、芘、蒽酮等多种多环芳烃,对于多环芳烃有机物的去除具有一定的广谱性。尤其是对于四环及四环以上的多环芳烃,如荧蒽等具有良好的降解效果。而且,本发明的多环芳烃降解菌对浓度较高的荧蒽溶液耐受力较强,可耐受高达300mg/L的荧蒽浓度,并适用于含荧蒽废水的生物处理。

附图说明

图1是本发明实施例中不同荧蒽浓度条件下YE-WL-2菌株对荧蒽的降解率变化图。

图2是本发明实施例中不同培养时间下YE-WL-2菌株对荧蒽的降解率变化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。

本实施例提供了一种多环芳烃降解菌,所述降解菌为红球菌(Rhodococcus sp.)YE-WL-2菌株,所述降解菌的保藏号为CCTCC【M 2016517】,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址:中国武汉武汉大学,保藏日期:2016年9月23日。

该菌株属于革兰氏阳性菌,命名为YE-WL-2,菌株的形态特征为:生长缓慢,菌落较小,LB平板上菌落呈橙红色,圆形,边缘齐整。菌株在生长过程中能耐受浓度高达300mg/L的荧蒽,最适生长条件为:pH7.0,温度30℃。革兰氏阳性菌在菌剂制备中,相对于革兰氏阴性菌能够更好的成型,更有利于其开发和应用。

进一步地,将菌株送至北京金唯智生物技术公司进行测序,测定基因序列为SEQ ID No.1,将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),进行核苷酸序列Blast比对,得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列,结果表明YE-WL-2菌株与红球菌(Rhodococcus sp.)的基因序列的同源性在99%以上,分离菌株被鉴定为红球菌(Rhodococcus sp.)

本发明提供的细菌制备物为上述YE-WL-2菌株的无机盐培养基。

以下主要以多环芳烃为荧蒽为例,说明YE-WL-2菌株对其的降解性能。

本发明所提供的保藏号为CCTCC【M 2016517】的多环芳烃降解菌YE-WL-2菌株的培养方法中:无机盐培养基的组成如下:0.9gKH2PO4、6.5g Na2HPO4·12H2O、0.4g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O及1mL微量元素溶液,补蒸馏水至1000mL;所述微量元素溶液为:1g FeSO4·7H2O、1g MnSO4·H2O、0.25g Na2MoO4·2H2O、0.1g H3BO4、0.25g CuCl2·2H2O、0.25g ZnCl2、0.1g NH4·VO3、0.25g Co(NO3)2·6H2O、和0.1g NiSO4·6H2O溶于900mL蒸馏水中,再加入5mL浓H2SO4,最后补蒸馏水至1000mL。

具体地,荧蒽限制性无机盐液体培养基为:将荧蒽溶解于丙酮中,配成母液浓度为50g/L的荧蒽-丙酮溶液,在无菌操作条件下,取适量荧蒽母液于灭菌的三角烧瓶中,待丙酮挥发后,加入灭菌的上述无机盐培养基,使得荧蒽浓度为50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L。荧蒽限制性无机盐固体培养基:将无机盐分离培养基中加入琼脂后灭菌,在无菌操作条件下加入荧蒽母液,使荧蒽浓度为200mg/L,摇匀后倒平板。

在以荧蒽为唯一碳源能源的无机盐培养基中接种红球菌YE-WL-2,30℃、150rpm培养条件下,7d对50mg/L荧蒽的降解率达到40.6%,充分说明红球菌YE-WL-2这种革兰氏阳性菌对于多环芳烃的降解效率也能达到不错的水平,具有非常不错的应用前景。

实施例1:

红球菌YE-WL-2菌株的分离和鉴定

(一)由于多环芳烃主要存在于石油、煤中,因此焦化废水中含有较多的多环芳烃,本发明中的红球菌YE-WL-2菌株采用富集培养法从山西五麟焦化厂好氧池活性污泥中分离得到YE-WL-2菌株,具体步骤如下:

(1)配制培养基:将固体荧蒽预先溶于丙酮中,在无菌操作的条件下,在250mL三角瓶中加入适量荧蒽母液,待丙酮挥发完全,加入灭菌后的无机盐培养基。

无机盐培养基配方如下:0.9g/L KH2PO4,6.5g/L Na2HPO4·12H2O,0.4g/L(NH4)2SO4,0.2g/L MgSO4·7H2O,每1L培养基加入1mL微量元素溶液,(微量元素溶液配制:1g FeSO4·7H2O,1g MnSO4·H2O,0.25g Na2MoO4·2H2O,0.1g H3BO4,0.25g CuCl2·2H2O,0.25g ZnCl2,0.1g NH4·VO3,0.25g Co(NO3)2·6H2O,0.1g NiSO4·6H2O,溶解于900mL蒸馏水中,加5mL浓H2SO4,补蒸馏水至1000mL)。

(2)驯化培养:向100mL灭菌的荧蒽限制性无机盐液体培养基中接入5mL山西五麟焦化厂好氧池活性污泥,于30℃、150r/min条件下的摇床中振荡培养7天,取5mL菌液接种到100mL新培养基中,重复转接5次。荧蒽起始浓度为50mg/L,以后每次转接荧蒽的浓度增加50mg/L,直到300mg/L为止。

(3)分离纯化:驯化培养好的菌液按10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释,取0.1mL 10-5稀释液涂在含有200mg/L荧蒽的无机盐培养基琼脂平板上,30℃倒置培养4-7天,挑取单菌落,进行3次划线分离纯化,得到纯化的菌株YE-WL-2。

(二)采用基因测序法对红球菌YE-WL-2菌株进行分类鉴定,具体步骤如下:

(1)细菌总DNA的制备:用天根公司基因组提取试剂盒提取YE-WL-2菌株的基因组DNA,作为PCR反应的模板。

(2)基因的PCR扩增:

使用如下扩增引物:

第一引物27F:5’-AgAgTTTgATCMTggCTCAg-3’[M=C,A];

第二引物1492R:5’-CggYTACCTTgTTACgACTT-3’[Y=T,C]。

PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR反应体系

PCR反应条件为:(95℃预变性5分钟)-(94℃变性1分钟-55℃退火30秒-72℃延伸2分钟)×35个循环-(72℃延伸10分钟)。

(3)PCR产物的纯化、克隆、测序和分析:

将PCR产物送至北京金唯智生物技术公司进行测序,测定16S rRNA基因序列,将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),进行核苷酸序列Blast比对,得到与相关菌株的16S rRNA基因序列同源的若干核苷酸序列,结果表明YE-WL-2菌株与红球菌(Rhodococcus sp.)的16S rRNA基因序列的同源性在99%以上,分离菌株被鉴定为红球菌(Rhodococcus sp.)。

(三)红球菌YE-WL-2菌株的形态鉴定特征如下:

YE-WL-2菌株属于革兰氏阳性菌类,生长缓慢,菌落较小,LB平板上菌落呈橙红色,圆形,边缘齐整。菌株在生长过程中能耐受浓度高达300mg/L的荧蒽,最适生长条件为:pH7.0,温度30℃。

实施例2:

红球菌YE-WL-2菌株的生理生化特征

(1)、淀粉水解试验

培养基配制:在牛肉膏3g/L、蛋白胨10g//L、NaCl 5g/L组成的肉汤培养基中添加可溶性淀粉,使其在培养基中的终浓度为0.2%,加入2%的琼脂,121℃灭菌20min,在无菌操作情况下倒平板待用。鲁哥氏碘液:1g碘、2g碘化钾,先用少量的水将碘化钾溶解,再加入碘片,待碘完全溶解后,加水稀释至300ml。取菌株点接于平板上,30℃培养2~4d,形成菌落后,在平板上滴加鲁哥氏碘液,以铺满菌落周围。阳性反应(淀粉被水解)为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈;阴性反应则菌落周围没有透明圈。

(2)、V-P实验

培养基配制:蛋白胨5g,葡萄糖5g,NaCl 5g,蒸馏水1000ml,调节pH7.0~7.2,分装试管,每管装4~5ml,121℃灭菌20min。试剂:40%KOH,6%α-萘酚纯酒精溶液。

在无菌操作情况下,将试验菌种接种于上述培养基中,于30℃培养4d,取培养液2.5ml,先加入α-萘酚纯酒精溶液0.6ml,再加入40%KOH水溶液0.2ml,摇动2~5min,阳性菌立即变红,如无红色出现,静置于30℃恒温箱,如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

(3)、甲基红试验

培养基配制:与V-P试验一致。试剂:甲基红0.02g,95%酒精60ml,蒸馏水40ml。

在无菌操作情况下,将试验菌接种于上述培养基中,于30℃培养4d,在培养液中滴加几滴甲基红,若培养基变红色,则为阳性,若培养基为黄色,为阴性。

(4)、明胶水解试验

培养基配制:蛋白胨0.5g,明胶12g,蒸馏水100ml,pH:7.2~7.4。分装于试管中,每管装4~5ml,121℃灭菌20min。

在无菌操作情况下,挑取试验菌穿刺接种于明胶高层约2/3深度,于20℃培养7~14d,每天观察实验结果,若因培养温度高使明胶本身液化应不加摇动,静置冰箱中待凝固后观察细菌是否被细菌液化,如被液化,则明胶水解阳性,否则为阴性。

(5)、Tween 80水解试验

培养基配制:蛋白胨1g,NaCl 0.5g,CaCl2 0.01g,琼脂1.5g,蒸馏水100ml。121℃灭菌20min,冷却至50℃,加入Tween 80使其终浓度为1%,倒平板备用。在无菌操作情况下,挑取试验菌点接于上述平板上,35℃培养2~4d,菌落周围有白色晕圈为阳性,否则为阴性。

(6)、过氧化氢酶活性

在干净载玻片上滴加1滴3%H2O2,用接种环挑取试验菌1环,在H2O2中涂抹,若有气泡产生为阳性,否则为阴性。

表2 YE-WL-2菌株生理生化特征

+:阳性反应;-阴性反应

实施例3:

红球菌YE-WL-2菌株对不同浓度的荧蒽的降解率测定

在pH7.0,温度30℃,荧蒽初始浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L的条件下,将YE-WL-2菌株的培养物接种于100mL上述以荧蒽为唯一碳源的无机盐培养基中,150r/min振荡培养7d后用以等体积乙酸乙酯萃取,经旋转蒸发仪蒸发至干,用甲醇定容后利用高效液相色谱法测定样品中残留荧蒽的含量,计算降解率。以荧蒽初始浓度为横坐标,以荧蒽降解率为纵坐标绘制柱形图,结果示于图1。

由图可见,随着荧蒽浓度的增加,YE-WL-2菌株对荧蒽的降解率在降低,培养7天,对50mg/L的荧蒽的降解率达40.6%,明显优于现有其他革兰氏阳性菌类的降解率,说明了YE-WL-2菌株对pHAs的降解能力,尤其是针对四环以及四环以上多环芳烃具有良好的降解能力。而且,从图中可以看出,YE-WL-2菌株还能够耐受浓度高达300mg/L的荧蒽。另外,革兰氏阳性菌相对于革兰氏阴性菌能够更好成型,更有利于其开发和应用。

实施例4:

红球菌YE-WL-2菌株对荧蒽的降解曲线测定

将红球菌YE-WL-2菌株的培养物接种于100mL的上述以荧蒽为碳源的无机盐培养基中,培养基pH为7.0,荧蒽初始浓度为50mg/L,于30℃、150r/min振荡培养,每隔7d取样,用高效液相色谱测定样品中残留荧蒽含量,以时间为横坐标,荧蒽残留浓度为纵坐标,绘制柱形图,结果见图2。

由图可见,荧蒽初始浓度为50mg/L时,YE-WL-2菌株可在7d内将培养基中荧蒽降解40%以上,培养14d对荧蒽的降解率达50%以上,培养21d对荧蒽的降解率达60%以上,同样说明菌株对于荧蒽有很好的降解效果。

实施例5:

红球菌YE-WL-2菌株对不同pHAs有机物为唯一碳源的生长情况

红球菌YE-WL-2在不同底物中培养后测定的生长情况如表3所示,该菌除了能够在荧蒽培养基中生长外,还可以在萘、菲、芘、蒽的琼脂培养基中生长,说明该菌对PAHs有机物的去除具有一定的广谱性,对各种pHAs都能起到良好的降解作用。

表3 YE-WL-2菌株在不同PAHs有机物培养基中的生长情况

“+”为有菌落生长,“++”为菌落生长较旺盛,“-”为无菌落生长

实施例6:

红球菌YE-WL-2菌株对不同pHAs废水的降解效果

将红球菌YE-WL-2菌株的培养物接种于100mL的上述以不同PAHs(萘、菲、蒽、芘)为碳源的无机盐培养基中,培养基pH为7.0,各PAHs初始浓度为50mg/L,于30℃、150r/min振荡培养,7d后取样,用高效液相色谱测定样品中残留PAHs含量。结果表明,红球菌YE-WL-2除了能够降解模拟荧蒽外,还能够利用萘、菲、蒽、芘进行生长。结果表明该菌株对萘,菲,蒽,芘的降解率分别为75.56%、69.54%、58.75%、37.23%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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