一种促进毕赤酵母产碱性果胶酶的方法与流程

本发明涉及一种促进毕赤酵母产碱性果胶酶的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术：

果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醛酸。该酶分布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业应用史。根据最适反应pH的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。PGL应用主要应用于纺织、食品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应条件温和等优点。然而目前对PGL进行分子改造研究较少，进行商品化的PGL也很少。

目前表达碱性果胶酶的宿主主要是毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。虽然通过发酵优化等手段可以有效提高碱性果胶酶的产量，但当达到一定限度碱性果胶酶的产量不能进一步提高，限制了碱性果胶酶的工业化生产，因此需从源头解决限制碱性果胶酶表达的因素。

毕赤酵母宿主虽然具有表达蛋白易于纯化等优点，然而目前的碱性果胶酶在毕赤酵母中表达时，存在表达量不高或者是外源基因原始核苷酸序列并不十分适合于毕赤酵母宿主的问题，从而限制了碱性果胶酶在毕赤酵母中的高效表达，酵母真核表达系统中存在的糖基化现象对碱性果胶酶的高效表达及性质存在极大影响。

因此，有必要对碱性果胶酶糖基化情况进行处理，进一步提高碱性果胶酶生产菌株的生产能力。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种有效促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达的方法，以抑制碱性果胶酶分泌过程中的糖基化现象。所述方法是在毕赤酵母培养基中添加衣霉素；所述毕赤酵母为表达碱性果胶酶基因的重组毕赤酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以pPIC9K为表达载体，以Pichia pastoris GS115为宿主表达碱性果胶酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组毕赤酵母为毕赤酵母GS115-pPIC9K-PGL。

在本发明的一种实施方式中，衣霉素添加量为10～40μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述衣霉素的添加浓度为20μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将毕赤酵母在含有以甲醇为诱导剂的BMMY培养基中，22-28℃，220rpm下培养。

在本发明的一种实施方式中，每24h向培养基中添加终浓度为10～20mL/L的甲醇。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导表达前经过活化；所述活化是将毕赤酵母接种至BMGY培养基，于30℃、220rpm条件下培养24h。

在本发明的一种实施方式中，所述BMGY培养基每L含有如下成分：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB 13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述BMMY培养基每L含有如下成分：蛋白胨20g，酵母粉10g，7-10％甲醇，YNB 13.4g，pH6.0的0.1mol的磷酸盐缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将重组毕赤酵母活化后接种至生长培养基BMGY中于30℃、220rpm条件下培养24h，然后再转接入诱导培养基BMMY中，于22-28℃，220rpm条件下摇瓶发酵，诱导碱性果胶酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述活化是接种于种子培养基YPD中培养14h；再以体积分数10％的接种量转入生长培养基BMGY。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导培养基BMMY中分别添加浓度为1、5、10、20、40μg/mL的衣霉素，诱导过程中每24h添加终浓度10～20mL/L的甲醇。

本发明还提供所述方法在食品、纺织、环境或造纸方面的应用。

本发明的有益效果：通过添加不同浓度衣霉素，碱性果胶酶的分泌水平有较明显的提升，当衣霉素浓度为20μg/mL碱性果胶酶产量最高，酶活为592.21U/ml较未添加衣霉素的对照酶活提高79.82％，极大的促进碱性果胶酶在毕赤酵母中的表达，且热稳定性有所提升，55℃保温30min的残余酶活由51.82％提升至57.20％。本发明得到的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。

说明书附图

图1为添加不同浓度衣霉素对PGL糖基化程度及分泌的影响；泳道1-6分别为K314Mopt添加0、1、5、10、20、40μg/mL衣霉素；

图2为添加不同浓度衣霉素对PGL胞外酶活及菌体生长的影响。

具体实施方式：

培养基：

种子培养基YPD(1L)：胰蛋白胨20g、酵母粉10g、葡萄糖20g。

生长培养基1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油40g，YNB 13.4g，pH6.0的0.1M的磷酸盐缓冲液。

诱导培养基(1L)：蛋白胨20g，酵母粉10g，甲醇9％，YNB 13.4g，pH6.0的0.1M的磷酸盐缓冲液。

碱性果胶酶酶活测定采用分光光度法：

样品预处理：发酵液8000rpm离心10min，胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。

酶活力检测：PGL反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol·L^-1，0.44mmol·L^-1的CaCl₂，pH9.4)2mL，待测样品20μL，无活性的酶液为空白对照。PGL反应条件为：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3mL磷酸溶液(0.03mol·L^-1)终止反应，在235nm处测定吸光度值。

单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。

实施例1

选用碧云天SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒配制12％分离胶和5％浓缩胶，具体操作方法见产品说明书。样品与5×上样缓冲液以体积比4:1混合，沸水浴10min，冷却后上样。电泳时，80V恒压电压，待指示剂进入分离胶后，电压调至150V，待指示剂至胶底时结束电泳。用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色，染色1h后脱色(SDS-PAGE图谱见附图1)。

SDS-PAGE结果如图1所示，从图中可以看出，当衣霉素添加浓度逐渐增加时，PGL蛋白条带逐渐下移蛋白大小逐渐变小，表明糖基化程度越来越低；同时当衣霉素浓度从0-20μg/mL不断增加时，在相同点样量条件下蛋白条带逐渐加粗，说明添加一定浓度的衣霉素可以有效促进PGL的分泌。

实施例2

培养方法：菌株在种子活化后接种到基本发酵培养基YPD，于30℃、220rpm条件下培养14h，以10mL菌液/100mL培养基的接种量转接至优化后的生长培养基BMGY培养基于30℃、220rpm条件下培养24h，再将菌株转入诱导培养基BMMY中22-28℃、220rpm，每24h添加终浓度为10-20mL/L的甲醇，诱导碱性果胶酶的表达。

其中BMMY培养基中分别添加浓度为0、1、5、10、20、40μg/mL衣霉素。

衣霉素对PGL酶活的影响如图2所示，通过添加不同浓度衣霉素，碱性果胶酶的分泌水平有较明显的提升，当衣霉素添加浓度0、1、5、10、20μg/mL逐渐增加，碱性果胶酶的产量也不断提高，当衣霉素浓度为20μg/mL碱性果胶酶产量最高，酶活为592.21U/ml较未添加衣霉素的对照酶活提高79.82％，极大的促进碱性果胶酶在毕赤酵母中的表达，当衣霉素添加浓度为40μg/mL时，由于衣霉素抑制了菌体的生长，因此酶活反而较添加浓度为20μg/mL时有所下降。

实施例3

培养方法：菌株在种子活化后接种到基本发酵培养基YPD，于30℃、220rpm条件下培养14h，以10mL菌液/100mL培养基的接种量转接至优化后的生长培养基，于30℃、220rpm条件下培养24h，再将菌株转入诱导培养基BMMY中22-28℃、220rpm，每24h添加终浓度10～20mL/L的甲醇，诱导碱性果胶酶的表达。

其中BMMY培养基中分别添加浓度为0、1、5、10、20、40μg/mL衣霉素，将培养96h的发酵液离心，在55℃保温30min，测定残余酶活，结果如表1所示。

表1添加不同浓度衣霉素对PGL热稳定性的影响。

从表1可以看出，添加衣霉素可以有效提高PGL热稳定性，添加不同浓度衣霉素时PGL在55℃保温30min后的残余酶活均有所提高，当衣霉素添加浓度为20μg/mL时，PGL55℃保温30min后的残余酶活由51.82％提高至57.20％，当衣霉素添加浓度为10μg/mL时，PGL55℃保温30min后的残余酶活更是由51.82％提高至64.77％，热稳定性提高十分明显。

实施例4

实施方式同实施例2，其区别在于以60μg/mL浓度将衣霉素加入至BMMY培养基中，发酵96小时后对发酵液中碱性果胶酶含量进行测定，结果显示PGL酶活下降严重，由添加40μg/mL时的579.85U/mL下降至403.25U/mL，较最高产量592.21U/mL下降了31.9％。这可能是由于太高的衣霉素添加浓度，严重抑制了宿主细胞的生长，细胞干重由26.0g/L下降至21g/L左右。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。