含D型非天然氨基酸的抗菌肽类似物及其合成与应用的制作方法

本发明涉及一种具有很好的抗酶解稳定性的含D型非天然抗菌肽类似物，本发明同时还涉及该含D型非天然抗菌肽类似物的和成功及其在制备抗菌药物的应用，属于生物化学技术领域。

背景技术：

近年来，滥用抗生素产生的耐药性问题日益严重，对人类疾病造成了巨大的威胁。寻找新的可替代抗生素的新药迫在眉睫。抗菌肽（Antimicrobial peptides），是生物体经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，来源广泛，其分子量小，大约在 3~6 kD 之间，有耐热、 耐酸性强，水溶性好，快速的杀菌能力等特点（Hancock REW， Scott MG. Proc Natl AcadSci USA，2000，97（16）：8856~ 8861）。抗菌肽的抗菌机制不同于普通抗生素，抗菌机制一般包括①快速破坏菌膜，使菌体内容物泄露，细菌死亡②抗菌肽与细菌细胞内容物（如DNA或RNA）作用，干扰细菌细胞正常的合成和代谢，导致菌体死亡（刘立伟，邓磊. 抗菌肽作用机制研究进展[J].河北化工，2012,35（7）：13-15）。所以，抗菌肽不易诱导耐药性的产生，使其成为生物医药领域的热门研究内容。

但是天然抗菌肽也存在一些弊端，比如：酶解稳定性差，生物利用度低；选择性不强，对哺乳动物细胞会产生破坏作用等，都会限制天然抗菌肽的进一步发展。因此，对天然抗菌肽进行改造成为研究的热点，其中非天然的D型氨基酸的引入常被作为一种常用的手段，优化抗菌肽，以提高耐受酶降解的能力（Di Grazia A， Cappiello F， Cohen H.et.al.D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions[J].Amino Acids，2015，47(12)：2505-19.）。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种含D型非天然氨基酸的抗菌肽类似物；

本发明的另一目的是提供上述含D型非天然氨基酸的抗菌肽类似物的合成方法；

本发明的还有一个目的，就是提供上述含D型非天然氨基酸的抗菌肽类似物在制备抗菌药物中的应用。

一、含D型非天然氨基酸的抗菌肽类似物的设计

本发明含D型非天然氨基酸的抗菌肽类似物，是在抗菌肽Anoplin的亲水面、疏水面分别引入D型非天然氨基酸，对天然抗菌肽Anoplin进行修饰而得。

在抗菌肽Anoplin的疏水面引入的D型氨基酸为D型Leu，引入位点分别为9和10位，命名为Anoplin-D9,10；其结构式为： GLLKRIKTLL-NH2。

在抗菌肽Anoplin的疏水面引入的D型氨基酸为D型Leu，引入位点分别为9，10和3位，命名为Anoplin-D9,10,3；其结构式为：GLLKRIKTLL-NH2。

在抗菌肽Anoplin的亲水面引入的D型氨基酸为D型Lys，引入位点分别为4和7位，命名为Anoplin-D4,7；其结构式为： GLLKRIKTLL-NH2。

在抗菌肽Anoplin的亲水面引入的D型氨基酸为D型Arg和D型Lys，引入位点分别为5和7位，命名为Anoplin-D5,7；其结构式为：GLLKRIKTLL-NH2 。

二、含D型非天然氨基酸的抗菌肽类似物的合成

以Rink-MBHA Resin 为起始原料, 采用Fmoc固相合成方法，按照设计的替换位点在天然抗菌肽Anoplin的相应位置引入非天然D型氨基酸，然后按序列延长肽链即得。

在天然抗菌肽Anoplin的亲水面引入的D型非天然型氨基酸为D型Arg或/和D型Lys：在天然抗菌肽Anoplin的疏水面引入的D型非天然氨基酸 为D型Leu。

三、含D型氨基酸抗菌肽类似物的体外抑菌实验

1. 对标准菌株的抑菌实验

采用常见的二倍稀释法测定药物的最小抑菌浓度，即MIC值。结果重复三次以上的、平行实验。结果见表1:

2. 酶解稳定性试验

具体方法： 将胰蛋白酶或糜蛋白酶配成一系列浓度 2000，200，20，2， 0.2， 0.02μg/ml。将抗菌肽Anoplin; Anoplin-D9,10；Anoplin-D9,10,3；Anoplin-D4,7; Anoplin-D5,7 用PBS配成相应浓度，将母液与不同浓度的胰酶孵育（1:4, v/v），不含胰酶的PBS做对照，孵育物37℃孵育6小时，随后，取出60℃烘箱灭活10min， 后用MH肉汤稀释到2×MIC，加入96孔板中，每孔100μl，设定3个复孔，然后加菌，每孔加菌100μl, 37℃孵育过夜，随后酶标仪测定OD600nm， 根据给药组的OD值比阴性组的OD值作为细菌存活率。

图1为耐受胰酶6小时稳定性试验结果。可以看出，Anoplin-D5,7和Anoplin-D4,7 耐受胰酶降解的能力显著提高，跟母肽Anoplin相比，耐受胰酶分别提高10⁴和10⁵倍。

图2 为耐受糜蛋白酶6小时稳定性试验结果。可以看出，四条D型类似物耐受糜蛋白酶的能力较母肽Anoplin显著提高，Anoplin-D5,7和Anoplin-D4,7 耐受糜蛋白酶降解的能力提高100倍，Anoplin-D9,10和Anoplin-D9,10,3 耐受糜蛋白酶降解的能力提高10倍。

3. RP-HPLC降解率曲线

抗菌肽Anoplin，与其D型类似物D-4,7; D-5,7 与200 μg/ml的胰酶37摄氏度孵育，在不同时间段，吸取孵育液，进行RP-HPLC分析，绘制降解率-时间曲线（图3）。可以看出，母肽Anoplin在120min时间内就被完全快速100%降解，而类似物D-5,7和D-4,7 降解率显著降低，在共孵育24小时（1440min），降解率仅为20%左右。

抗菌肽Anoplin，与其D型类似物D-4,7; D-5,7 与20μg/ml的糜蛋白酶37摄氏度孵育，在不同时间段，吸取孵育液，进行RP-HPLC分析，绘制降解率-时间曲线（图4）。可以看出，母肽Anoplin在300min时间内就被完全快速100%降解，而类似物D-5,7和D-4,7 降解率显著降低，在共孵育24小时（1440min），降解率仅为20%和15%左右。

抗菌肽Anoplin，与其D型类似物D-9,10; D-9,10,3与2μg/ml的糜蛋白酶37摄氏度孵育，在不同时间段，吸取孵育液，进行RP-HPLC分析，绘制降解率-时间曲线（图5）。可以看出，在相同时间间隔，母肽Anoplin的降解率均高于类似物D-9，10和D-9,10,3。

4. 抑制生物膜形成试验

孵育方法：将标准铜绿假单孢菌分别用胰蛋白胨大豆肉汤含0.5%葡萄糖（TSBG）培养到中间对数期，最终用TSBG稀释到5×105 CFU/ml. 将其加到96孔板中，每孔20 μl, 然后将抗菌肽按二倍稀释的方法，使其浓度分别是2×MIC，1×MIC, 0.5×MIC, 0.25×MIC, 0.125×MIC, 0.0625×MIC. 然后将药物分别加到孔中，每个浓度6个平行，将共孵育物37℃孵育24小时。

处理方法：到时间后将平板取出，吸去上清液，加入PBS洗，每孔洗2遍，然后加无水甲醇固定生物膜，固定15min，然后吸去，空气中晾干，然后每孔加入200μl ,0.1% 结晶紫染色15min, 染色后，将其吸去，用去离子水洗，每孔洗2遍，最后加入95%无水乙醇，释放染料15min, 快速测定595nm处的吸光值。

生物膜形成率=（OD给药组-OD阴性组）/OD阴性组

抑制生物膜形成率%= 1-生物膜的形成率

试验结果见图6。横坐标是药物浓度，纵坐标是抑制铜绿假单胞菌生物膜形成率，发现生物膜抑制率呈现出剂量依赖性，母肽Anoplin和类似物D-9,10; D-9,10,3; D-4,7; D-5,7在高浓度2×MIC时，呈现出98%以上的抑膜形成率。在低浓度1×MIC时，母肽Anoplin 和类似物D-9,10; D-5,7抑膜形成率有所降低，但D-9,10,3仍然保留了很强的抑制率。在0.5×MIC时， 母肽Anoplin，D-4,7, D-5,7几乎丧失了抑膜能力，抑制膜形成率低于10%。只有类似物D-9,10和D-9,10,3仍然可以抑制生物膜的形成，抑制率40%。在浓度低于0.5×MIC时，所有肽都不能表现出抑制生物膜形成的能力。

附图说明

图1为本发明含D型氨基酸抗菌肽类似物耐受胰酶6小时稳定性试验。

图2为本发明含D型氨基酸抗菌肽类似物耐受糜蛋白酶6小时稳定性。

图3为Anoplin、D型类似物D-4,7、D-5,7 与200 μg/ml的胰酶37摄氏度孵育不同时间的RP-HPLC降解率曲线。

图4为Anoplin、D型类似物D-4,7、D-5,7 与20 μg/ml的胰酶37摄氏度孵育不同时间的RP-HPLC分析。

图5为Anoplin、D型类似物D-9,10、D-9,10,3与2μg/ml的糜蛋白酶37摄氏度孵育不同时间的RP-HPLC分析。

图6为本发明含D型氨基酸抗菌肽类似物抑制生物膜形成试验。

图7为纯肽Anoplin-D9,10的RP-HPLC分析谱图。

图8为纯肽Anoplin-D9,10,3的RP-HPLC分析谱图。

图9为纯肽Anoplin-D4,7的RP-HPLC分析谱图。

图10为纯肽Anoplin-D5,7的RP-HPLC分析谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明D型氨基酸抗菌肽类似物的结构、合成作进一步说明。

实施例1、类似物Anoplin-D9,10的合成

称取Rink-MBHA 树脂，取代值为0.43mmol/g, 合肽量为0.15mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分搅拌溶胀树脂，时间为30min, 然后加入10%的六氢吡啶脱树脂Fmoc保护，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗树脂，同样每次2min, 共洗4遍，最后使用茚检指示剂（苯酚：氰化钾吡啶：茚三酮=1:2:1）检验树脂是否脱去Fmoc保护基团，沸水煮树脂1min，立即观察，树脂显蓝色，则证明Fmoc基团已脱出，按合肽的序列，从C末端开始，称取第一个氨基酸为d-Leu，1.5倍过量，加入HOBT (1倍过量)，HBTU(1倍过量)，待氨基酸溶解后，加入启动剂DIEA (4倍过量)。上述氨基酸与树脂共同搅拌反应，时间1h，反应结束后，茚检试剂检验，沸水煮树脂1min, 树脂变为无色，说明D型Leu氨基酸成功接上，如此重复操作，直至后续接完d-leu-Thr-Lys-Ile-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly氨基酸序列。经RP-HPLC制备纯化，使用C18柱纯化，洗脱条件为20%-60%乙腈，8ml/min。纯肽Anoplin-D9,10的RP-HPLC分析谱图见附图说明7。

实施例2 类似物Anoplin-D9,10,3的合成

称取Rink-MBHA 树脂，取代值为0.43mmol/g, 合肽量为0.25mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分搅拌溶胀树脂，时间为30min, 然后加入15%的六氢吡啶脱树脂Fmoc保护，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗树脂，同样每次2min, 共洗4遍，然后茚检指示剂（苯酚：氰化钾吡啶：茚三酮=1:2:1）检验，树脂显蓝色，证明树脂上的Fmoc基团已脱出，按合肽的序列，从C末端开始，称取第一个氨基酸d-Leu氨基酸，2倍过量，加入HOBT (3倍过量)，HBTU(3倍过量)，待氨基酸溶解后，加入启动剂DIEA (6倍过量)。上述氨基酸与树脂共同搅拌反应，时间1.5h，反应结束后，茚检试剂检验，树脂变为无色，说明第一个氨基酸成功接上，如此重复操作，后续接完d-leu-Thr-Lys-Ile-Arg-Lys-d-Leu-Leu-Gly氨基酸序列。经RP-HPLC制备纯化，使用C18柱纯化，洗脱条件为20%-60%乙腈，8ml/min。纯肽Anoplin-D9,10,3的RP-HPLC分析谱图见附图说明8。

实施例3、类似物Anoplin-D4,7的合成

称取Rink-MBHA 树脂，取代值为0.43mmol/g, 合肽量为0.2mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分搅拌溶胀树脂，时间为30min, 然后加入15%的六氢吡啶脱树脂Fmoc保护，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗树脂，同样每次2min, 共洗4遍，然后茚检指示剂（苯酚：氰化钾吡啶：茚三酮=1:2:1）检验，树脂显蓝色，证明Fmoc基团已脱出，按合肽的序列，从C末端开始，称取第一个氨基酸Leu，3倍过量，加入HOBT (5倍过量)，HBTU(5倍过量)，待氨基酸溶解后，加入启动剂DIEA (6倍过量)。上述氨基酸与树脂共同搅拌反应，时间1h，反应结束后，茚三酮检验，若树脂变为无色，说明氨基酸成功接上，如此重复操作，直至接完后面的序列leu-Thr-d-Lys-Ile-Arg-d-Lys-Leu-Leu-Gly。经RP-HPLC制备纯化，使用C18柱纯化，洗脱条件为20%-60%乙腈，8ml/min。纯肽Anoplin-D4,7的RP-HPLC分析谱图见附图说明9.

实施例4、类似物Anoplin-D5,7的合成

称取Rink-MBHA 树脂，取代值为0.43mmol/g, 合肽量为0.2mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分搅拌溶胀树脂，时间为30min, 然后加入15%的六氢吡啶脱树脂Fmoc保护，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗树脂，同样每次2min, 共洗4遍，然后然后茚检指示剂（苯酚：氰化钾吡啶：茚三酮=1:2:1）检验，树脂显蓝色，显蓝色，证明Fmoc基团已脱出，按合肽的序列，从C末端开始，称取第一个氨基酸Leu，3.4倍过量，加入HOBT (6倍过量)，HBTU(6倍过量)，待氨基酸溶解后，加入启动剂DIEA (8倍过量)。上述氨基酸与树脂共同搅拌反应，时间2h，反应结束后，茚检指示剂检验，若树脂变为无色，说明氨基酸成功接上，如此重复操作，直至按序列接完剩下的氨基酸leu-Thr-d-Lys-Ile-d-Arg- Lys-Leu-Leu-Gly。经RP-HPLC制备纯化，纯肽Anoplin-D5,7的RP-HPLC分析谱图见附图说明10。