本发明涉及间充质干细胞的制备技术，特别涉及一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，其可在体外适宜条件下连续传代培养、冻存。由于MSCs在特定条件下可分化为不同细胞，故其逐渐成为细胞治疗和基因治疗领域中极具实用价值的细胞来源。脐带属于胚胎外组织，其含有大量多向分化的干细胞，细胞生长扩增速度快，且脐带在胎儿娩出后成为“废弃物”，所以取材方便，来源丰富，更无伦理学问题，可作为极佳的间充质干细胞来源。
公开号为CN101643719A、公开日为2010年2月10日的中国专利公开了一种简化的脐带间充质干细胞分离培养方法，该方法包括下述步骤：脐带去除生理盐水清洗→剪切→离心弃上清→组织块用10％αMEM培养，每3天换液→至10天左右细胞达80％左右融合时传代→以后每隔3-5天传代一次。
在细胞表型鉴定研究发现，通过这种方法分离培养得到的脐带间充质干细胞纯度仍有待提高。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，具有提高脐带间充质干细胞纯度的效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：
i.取新生儿新鲜的离体脐带，将其置于控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中，保存待用；
ii.取出经步骤i处理的脐带，用控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗，至无血迹残留；
iii.在控温为2～5℃的浸泡液环境中，剪切洗涤后的脐带，剪切过程中剔除动静脉；所述脐带和浸泡液的用量比为1g:10～20ml，所述浸泡液包括0.9～1.0g/L的葡萄糖、10～20g/L的乙醇，余量为水；
iv.取剪切后的脐带，用控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2～3次，将其放入培养瓶后置于控温为-80～-70℃且控真空度为10～30Pa的环境下5～20min，除去脐带上的溶剂；
v.取培养瓶密封处理，将其置于控温为-40～-35℃的环境中，待培养瓶的温度升至-40～-35℃时则将培养瓶转移至控温为-5～0℃的环境中，待培养瓶的温度升至-5～0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中，至其内的脐带解冻完全；
vi.取经步骤v处理的培养瓶，于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液；其中所述脐带和PBS液的用量比为1g:0.5～1ml，振荡1～5min使脐带和PBS液充分接触；
vii.取经步骤vi处理的培养瓶，于其内加入第一混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-5min，15℃恒温→5.01-20min，匀速升温至25℃→20.01-30min，25℃恒温→30.01-40min，匀速升温至37℃→40.01-75min，37℃恒温→75.01-90min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:2～5ml，所述第一混合酶溶液包括1～2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、2～3mg/g的胶原酶II、5～10mg/g的乙醇，余量为水；
viii.取经步骤vii处理的培养瓶，于其内加入第二混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-2min，25℃恒温→2.01-10min，匀速升温至30℃→10.01-15min，30℃恒温→15.01-20min，匀速升温至37℃→20.01-60min，37℃恒温→60.01-75min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:2～5ml，所述第二混合酶溶液包括0.5～1mg/g的胶原酶II、0.5～1mg/g透明质酸酶、0.2～0.5mg/g的DNA水解酶、2～5mg/g的乙醇，余量为水；
IX.取经步骤viii处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG-DMEM培养基，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.2～0.5ml:1～2ml:2～5ml；
X.取经步骤IX处理的培养瓶，加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min，弃上清；其中所述脐带和PBS液用量比为1g:2～5ml；
XI.取经步骤X处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min，弃上清，重复2～3次；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5～1ml:2～5ml:2～5ml；
XII.取经步骤XI处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，混匀；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5ml:1ml:1ml；
XIII.取经步骤XII处理后的样品的100μL样品，向其加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mg NaCl，置于37℃、体积分数为5％的CO2、湿度为95％RH的环境中静置培养；4天后换液，去除未贴壁细胞，以后每2天更换一次；待培养皿中的细胞达到80％融合，弃去培养液，PBS漂洗1次后，加37℃、胰蛋白酶-EDTA消化液消化2min，轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基终止消化，收集吹打后所得细胞，离心，弃上清，用加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mg NaCl重新混匀，1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、体积分数5％CO2、湿度为95％RH的环境中静置培养，每2天更换一次换液1次，待培养皿中的原代干细胞达到80％融合用同样方法消化传代。
细胞表型鉴定研究发现，上述技术方案在扩增培养时，其细胞达80％融合时间可缩减至5天以内，增加了其培养速度；且其鼠抗人PE标记的CD73(作为间充质干细胞的标志性抗原)阳性率提高至91％以上，提高了间充质干细胞纯度，产品品质得到提高。
进一步优选为：经步骤i处理后的脐带在48hr以内用步骤ii处理。
进一步优选为：步骤iii中，脐带剪成1mm×1mm×1mm大小。
进一步优选为：步骤iii中，所述浸泡液还包括0.2～0.5g/L的L-谷氨酸。
进一步优选为：所述浸泡液包括1.0g/L的葡萄糖、0.4g/L的L-谷氨酸、18g/L的乙醇，余量为水。
进一步优选为：步骤vi中，所述脐带和PBS液的用量比为1g：1ml。
进一步优选为：步骤vii中，所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:4ml，所述第一混合酶溶液包括2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、3mg/g的胶原酶II、8mg/g的乙醇，余量为水；
步骤viii中，所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:3.5ml，所述第二混合酶溶液包括0.8mg/g的胶原酶II、1mg/g透明质酸酶、0.5mg/g的DNA水解酶、5mg/g的乙醇，余量为水。
进一步优选为：步骤IX中，所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.4ml:1.5ml:4ml；
步骤X中，所述脐带和PBS液用量比为1g:3ml；
步骤XI中，所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5ml:2ml:5ml。
进一步优选为：所述LG-DMEM培养基的基础培养基包括1000mg/L的葡萄糖、4.0mM的L-谷氨酸、110mg/L丙酮酸钠。
进一步优选为：所述LG-DMEM培养基的基础培养基还包括25mM的HEPES。
细胞表型鉴定研究发现，上述技术方案在扩增培养时，其细胞达80％融合时间可进一步缩减至3天以内，进一步增加了其培养速度；且其鼠抗人PE标记的CD73(作为间充质干细胞的标志性抗原)阳性率进一步提高至98％以上，进一步提高间充质干细胞纯度，产品品质得到提高。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
细胞表型鉴定研究发现，本申请在扩增培养时，其扩增培养速度快、得到的间充质干细胞纯度高，其产品品质得到一定的提高，其中细胞达到80％融合时间在5天以内且鼠抗人PE标记的CD73阳性率高于91％，其中其最佳样品达到80％融合时间在3天以内且鼠抗人PE标记的CD73阳性率高于98％。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的保护范围内都受到专利法的保护。
实施例1：各种原材料的制备
(1)脐带：自医院妇产科产房采集。
(2)含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液：
称取1.42g Na2HPO4、0.24g KH2PO4、8g NaCl和0.2g KCl，加入800ml去离子水搅拌溶解，加入0.06g青霉素钠和0.1g链霉素，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加去离子水定容至1L，高温高压下灭菌，即得，保存于室温中；该溶液中的青霉素和链霉素折算成效价分别为100U/ml和100U/ml；
其中，青霉素钠和链霉素均购自Gibco公司。
(3)浸泡液：
按所需称取一定量的葡萄糖、(部分添加有L-谷氨酸、)乙醇，加入部分去离子水搅拌溶解，最后用去离子水定容，即得；每个成分的具体浓度参见具体实施例。
(4)第一混合酶溶液
按所需称取一定量的胰蛋白酶-EDTA消化液、胶原酶II、乙醇，加入部分去离子水搅拌溶解，最后用去离子水定容，即得；每个成分的具体浓度参见具体实施例，其中胰蛋白酶-EDTA消化液和胶原酶II均购自Gibco公司。
(5)第二混合酶溶液
所需称取一定量的胶原酶II、透明质酸酶、DNA水解酶、乙醇，加入部分去离子水搅拌溶解，最后用去离子水定容，即得；每个成分的具体浓度参见具体实施例，其中胶原酶II购自Gibco公司，透明质酸酶和DNA水解酶均购自美国Amresco公司。
(6)LG-DMEM培养基的基础培养基
购自Gibco公司，且有两个类型，分别为含HEPES型和不含HEPES型，
其中，HEPES型中葡萄糖为1000mg/L，L-谷氨酰胺为4.0mM，丙酮酸钠为110mg/L，HEPES为25mM；
不含HEPES型中葡萄糖为1000mg/L，L-谷氨酰胺为4.0mM，丙酮酸钠为110mg/L且其不含HEPES。
(7)胎牛血清：购自Hyclone公司。
(8)含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG-DMEM培养基、或含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基
按所需称取一定量的与(2)来源相同的青霉素和链霉素，加入(6)的LG-DMEM培养基的基础培养基分散均匀并定容。
实施例2-4：一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，包括以下步骤：
i.取新生儿新鲜的离体脐带，将其置于控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液中，保存待用；
ii.取出经步骤i处理的脐带，用控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液多次冲洗，至无血迹残留；
iii.在控温为2～5℃的浸泡液环境中，剪切洗涤后的脐带，剪切过程中剔除动静脉；所述脐带和浸泡液的用量比为1g:10～20ml，所述浸泡液包括0.9～1.0g/L的葡萄糖、0.2～0.5g/L的L-谷氨酸、10～20g/L的乙醇，余量为水；
iv.取剪切后的脐带，用控温为2～5℃且含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液冲洗2～3次，将其放入培养瓶后置于控温为-80～-70℃且控真空度为10～30Pa的环境下5～20min，除去脐带上的溶剂；
v.取培养瓶密封处理，将其置于控温为-40～-35℃的环境中，待培养瓶的温度升至-40～-35℃时则将培养瓶转移至控温为-5～0℃的环境中，待培养瓶的温度升至-5～0℃时则将培养瓶转移至控温为37℃的环境中，至其内的脐带解冻完全；
vi.取经步骤v处理的培养瓶，于其内加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液；其中所述脐带和PBS液的用量比为1g:0.5～1ml，振荡1～5min使脐带和PBS液充分接触；
vii.取经步骤vi处理的培养瓶，于其内加入第一混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-5min，15℃恒温→5.01-20min，匀速升温至25℃→20.01-30min，25℃恒温→30.01-40min，匀速升温至37℃→40.01-75min，37℃恒温→75.01-90min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:2～5ml，所述第一混合酶溶液包括1～2mg/g的胰蛋白酶-EDTA消化液、2～3mg/g的胶原酶II、5～10mg/g的乙醇，余量为水；
viii.取经步骤vii处理的培养瓶，于其内加入第二混合酶溶液，振荡处理，振荡用的水浴控温曲线为：0-2min，25℃恒温→2.01-10min，匀速升温至30℃→10.01-15min，30℃恒温→15.01-20min，匀速升温至37℃→20.01-60min，37℃恒温→60.01-75min，自然冷却至25℃；其中所述脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:2～5ml，所述第二混合酶溶液包括0.5～1mg/g的胶原酶II、0.5～1mg/g透明质酸酶、0.2～0.5mg/g的DNA水解酶、2～5mg/g的乙醇，余量为水；
IX.取经步骤viii处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和0.1g/L链霉素的LG-DMEM培养基，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.2～0.5ml:1～2ml:2～5ml；
X.取经步骤IX处理的培养瓶，加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min，弃上清；其中所述脐带和PBS液用量比为1g:2～5ml；
XI.取经步骤X处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，于20～25℃下静置2～5min并在此温度下离心5～8min，弃上清，重复2～3次；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5～1ml:2～5ml:2～5ml；
XII.取经步骤XI处理的培养瓶，加入胎牛血清、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基，混匀；其中所述脐带、胎牛血清、PBS液和LG-DMEM培养基的用量比为1g:0.5ml:1ml:1ml；
XIII.取经步骤XII处理后的样品的100μL样品，向其加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mg NaCl，置于37℃、体积分数为5％的CO2、湿度为95％RH的环境中静置培养；4天后换液，去除未贴壁细胞，以后每2天更换一次；待培养皿中的细胞达到80％融合，弃去培养液，PBS漂洗1次后，加37℃、胰蛋白酶-EDTA消化液消化2min，轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基终止消化，收集吹打后所得细胞，离心，弃上清，用加入0.5ml的胎牛血清、12ml的DMEM/F12培养基和1mg NaCl重新混匀，1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、体积分数5％CO2、湿度为95％RH的环境中静置培养，每2天更换一次换液1次，待培养皿中的原代干细胞达到80％融合用同样方法消化传代。
其中，实施例2-4的具体参数如表1所示。
表1实施例2-4的原料信息
实施例5：一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，与实施例1的区别在于，步骤IX和步骤XI中，其LG-DMEM培养基的基础培养基均为不含HEPES型。
实施例6：一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，与实施例1的区别在于，步骤iii的浸泡液组成中不含L-谷氨酸。
实施例7：一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，与实施例1的区别在于，经步骤i处理后的脐带在保存100hr后用步骤ii处理。
实施例8：一种人脐带间充质干细胞的分离和培养方法，与实施例1的区别在于，步骤iii中，脐带剪成3mm×3mm×3mm大小。
性能表征
(1)参照样的制备
参照样1，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤iii中，浸泡液组成为：葡萄糖0.45g/L、乙醇5g/L，余量为水；且脐带和浸泡液的用量比为1g:5ml。
参照样2，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤iii中，浸泡液组成为：葡萄糖2g/L、乙醇40g/L，余量为水；且脐带和浸泡液的用量比为1g:40ml。
参照样3，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤vii中，第一混合酶溶液的组成为：胰蛋白酶-EDTA消化液0.5mg/g、胶原酶II 1mg/g、乙醇2.5mg/g，余量为水；且脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:1ml。
参照样4，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤vii中，第一混合酶溶液的组成为：胰蛋白酶-EDTA消化液4mg/g、胶原酶II 6mg/g、乙醇20mg/g，余量为水；且脐带和第一混合酶溶液的用量比为1g:10ml。
参照样5，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤viii中，第二混合酶溶液的组成为：胶原酶II 0.25mg/g、透明质酸酶0.25mg/g、DNA水解酶0.1mg/g、乙醇1mg/g，余量为水；且脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:1ml。
参照样6，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤viii中，第二混合酶溶液的组成为：胶原酶II 2mg/g、透明质酸酶2mg/g、DNA水解酶1mg/g、乙醇10mg/g，余量为水；且脐带和第二混合酶溶液的用量比为0.5g:10ml。
参照样7，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤IX中，脐带、胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基的用量比为1:0.1:0.25:1。
参照样8，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤IX中，脐带、胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基的用量比为1:1:4:10。
参照样9，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤X中，脐带和PBS液的用量比为1:1。
参照样10，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤X中，脐带和PBS液的用量比为1:10。
参照样11，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤XI中，脐带、胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基的用量比为1:0.25:1:1。
参照样12，其制备方法和实施例1的区别在于，步骤XI中，脐带、胎牛血清、PBS液、LG-DMEM培养基的用量比为1:2:10:10。
参照样13，其制备方法和实施例1的区别在于，未采用步骤v和步骤vi。
参照样14，其制备方法和实施例1的区别在于，其步骤XIII改为：取混匀后的100μL样品(作为原代干细胞)，将其置于无菌培养瓶中，向每个培养瓶中加入1ml的胎牛血清(购自Hyclone公司)和10ml的DMEM/F12培养基(1:1，购自Hyclone公司)，置于37℃、体积分数为5％的CO2、湿度为95％RH的环境中静置培养；4天后换液，去除未贴壁细胞，以后每2天更换一次；待培养皿中的细胞达到80％融合，弃去培养液，PBS漂洗1次后，加37℃、胰蛋白酶-EDTA消化液消化2min，轻轻拍打瓶壁促进细胞从瓶底脱离，然后加入含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液、含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的LG-DMEM培养基终止消化，收集吹打后所得细胞，离心，弃上清，用培养液重新混匀，1∶2的比例进行传代接种，置于37℃、体积分数5％CO2、湿度为95％RH的环境中静置培养，每2天更换一次换液1次，待培养皿中的原代干细胞达到80％融合用同样方法消化传代。
参照样15，参照CN101643719A实施例1制备。
(2)细胞表型鉴定
试验对象：以实施例2-8为试验样，以参照样1-12为对照，进行细胞表型鉴定试验。
试验内容：培养传代3代后，取对数生长期第4代细胞，配制成1×109L-1悬液，用鼠抗人PE标记的CD73及同型对照10μL，4℃避光孵育30min，PBS液洗涤3次，10g/L多聚甲醛固定，流式细胞仪检测分析。每个样品均平行制备3次，每次制备的样品细胞表型鉴定3次且提高流式细胞仪检测分析得到的鼠抗人PE标记的CD73阳性率取平均值。
试验结果：如表2所示。表2显示，相比参照样而言，实施例2-8制备得到的悬液在经扩增培养时，其细胞达80％融合时间短、鼠抗人PE标记的CD73(作为间充质干细胞的标志性抗原)阳性率高且其平行试验的结果接近，这说明实施例2-8制备得到的悬液扩增培养速度快、得到的间充质干细胞纯度高，其产品品质高于参照样，且实施例2制备得到的悬浮液为最佳样品。
表2细胞表型鉴定的结果