一种间充质干细胞分泌素的培养方法与流程

本发明涉及干细胞培养领域，特别涉及一种间充质干细胞分泌素的培养方法。

背景技术：

间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

而且间充质干细胞在培养过程中所产生的间充质干细胞分泌素也是现今社会大众所追捧的产品，而且学术界对于来自间充质干细胞的分泌素的潜在医疗用途正展开深入的探讨，近年已有分泌素的正面医疗效果的文献出现，如改善皮肤皱纹，心衰竭，脑退化，视力，寿命延长，等等。近年有大量文献亦指出分泌素的其它潜在医药价值，暂时研究得最深入的便是其改善心脏衰竭的功用，研究指出干细胞分泌物中所含的外吐小体(exosome)具有一定医疗用途。

但是，现有技术中，间充质干细胞在培养的过程中需要大量的培养瓶和空间来供间充质干细胞进行依附，从而需要高昂的成本；同时，分泌素中的蛋白质在浓缩时会大量流失，而且产品中带有高浓度的盐及细胞液等杂质。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种培养所需空间小且分泌素中蛋白的纯度高的间充质干细胞分泌素的培养方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：一种间充质干细胞分泌素的培养方法，包括以下步骤：

S1、取间充质干细胞加入到生物反应器中进行培养，得到目标数量的间充质干细胞，用含双抗的PBS缓冲液对生物反应器中的间充质干细胞进行清洗；

S2、向生物反应器中加入完全培养基I和含双抗的PBS缓冲液继续进行培养；

S3、收集生物反应器中的上清液，向所述上清液中加入PCH絮凝剂，使上清液中的蛋白质发生沉淀；

S4、将S3中含有沉淀的上清液倒入到滤纸上进行过滤，然后再将沉淀的蛋白质转移到半透膜中，然后用去离子水对半透膜中的蛋白质沉淀进行数次清洗；

S5、利用去离子水将蛋白质从半透膜上充质容器中，所得的蛋白质液体即为间充质干细胞分泌素。

利用含有双抗的PBS缓冲液对间充质干细胞进行清洗，这样一方面可以有效地清除间充质干细胞表面的杂质，同时，也可以对间充质干细胞进行初步消毒。

同时，生物反应器技术替代传统的细胞培养瓶去制作间充质干细胞分泌素，大幅缩减成本及所需空间；例如要制作来自两亿个干细胞的分泌素，在传统的方法上需要500个T150的细胞培养瓶；而本发明只需要一个3公升的生物反应器，只相等于20个T150细胞培养瓶的体积。而且PCH絮凝剂系直链高分子聚合物，相对分子质量约1护，经电泳试验证明其属阳离子表面活性剂。根据高分子的絮凝作用原理和胶体表面的性质，它对表面带负电荷的污泥及蛋白质具有优良的絮凝作用，从而很容易将其与培养基中的高盐及完全培养基I等杂质发生分离，从而一方面有利于提高间充质干细胞分泌素的纯度，另一方面PCH絮凝剂也不会导致间充质干细胞分泌素发生变性。

另外，通过将蛋白质沉淀并用滤纸进行过滤，这样一方面能够提高蛋白质与上清液的分离，另一方面也能够降低蛋白质的损失，进而大大提高了间充质干细胞的生产效率。

作为优选，所述完全培养基I包括含体积分数为1％～3％胎牛血清、35～45％MCDB201、7～13μg/L血小板衍生生长因子、8～12μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5～15μg/L表皮生长因子的DF12培养基。

作为优选，所述完全培养基I包括含体积分数为2％胎牛血清、40％MCDB201、10μg/L血小板衍生生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L表皮生长因子的DF12培养基。

胎牛血清能够为间充质干细胞的生长提供基础的环境条件，同时，各种生长因子的加入，能够有助于促进间充质干细胞的分裂。进而，有利于提高间充质干细胞的培养效率。

作为优选，向配置好的完全培养基I内加入碳酸氢钠溶液，将完全培养基I的pH值调节至7.2～7.4。

由于完全培养基I中的表皮生长因子的DF12培养基其在酸性的条件下容易偏黄从而影响培养过程中的观察，而碳酸氢钠能够起到缓冲作用，并且碳酸氢钠分解后产生的钠盐和CO₂都是细胞生存所需要的物质，所以也能够为细胞提供一定的物质补给。

作为优选，S2中完全培养基I和含双抗的PBS缓冲液体积比为1∶3～5。

下表为不同完全培养基I和含双抗的PBS缓冲液的体积比(V₁∶V₂)对各种间充质干细胞的繁殖率的影响：

从上述表中可以看出当完全培养基I和含双抗的PBS缓冲液体积比为1∶3～5时，各种间充质干细胞在24小时中的繁殖率都接近于最高值，并且当完全培养基I和含双抗的PBS缓冲液体积比为1∶4的时候，各类间充质干细胞的繁殖率最高。

作为优选，S3中的PCH絮凝剂所占上清液的质量分数为0.3％～0.5％。

根据以下试验数据，在室温下，PCH絮凝剂在上清液中的质量分数与上清液物理性质之关系：

从上表可以很看出，蛋白质沉淀在PCH絮凝剂于上清液中的质量分数为0.3％～0.5％时絮凝现象较为明显。

作为优选，生物反应器的转速为50rpm，其内部的温度为37℃，且含有体积分数为5％的CO₂，并保持湿度为饱和状态。

将生物反应器内含有体积分数为5％的CO₂，这样可以保证充质干细胞的正常呼吸繁殖，而且37℃是各类酶活性比较强的温度，从而有利于保证间充质干细胞的正常新陈代谢，另外，生物反应器的转速为50rpm，这样可以使间充质干细胞始终与生物反应器的壁面紧贴，使得间充质干细胞能够有依附载体。

作为优选，S2培养过程中每24h加入新的完全培养基I。

这样是为了对间充质干细胞及时进行完全培养基I的补充，从而保证间充质干细胞能够正常地产生分泌素。

作为优选，S5中所得到的间充质干细胞分泌素还需经过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒。

由于一般细菌的致死点均为温度68℃与时间30min以下，所以将间充质干细胞分泌素经此法处理后，可杀灭其中的致病性细菌和绝大多数非致病性细菌；同时，间充质干细胞分泌素加热后突然冷却，急剧的热与冷变化也可以促使细菌的死亡。从而能够有效地对间充质干细胞分泌素起到灭菌的作用，并且间充质干细胞分泌素在这个过程中不会被破坏，进而能够进一步延长间充质干细胞分泌素的保存时间。

作为优选，消毒后的间充质干细胞分泌素进行蛋白定量和分装的步骤，最后通过冷冻干燥将所述间充质干细胞分泌素制成粉末，低温保存。

将间充质干细胞分泌素制成粉末，这样可以降低间充质干细胞分泌素被细菌污染的可能性，从而大大延长了保存的时间。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.通过PCH絮凝剂将上清液中的蛋白质进行沉淀，这样可以有利于通过过滤的方式将蛋白质与上清液发生分离，然后用半透膜进行包裹并用去离子水进行清洗，这样可以减少蛋白质的流失；

2.将间充质干细胞分泌素还需经过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒，通过这种方式能够有效地对间充质干细胞分泌素进行消毒，但又不会造成间充质干细胞分泌素的破坏；

3.向完全培养基I中加入碳酸氢钠，这样能够保证间充质干细胞的环境为其所适应的弱碱性的，同时，也能够为间充质干细胞提供需要的二氧化碳。

附图说明

图1是间充质干细胞分泌素的培养流程图。

具体实施方式

以下结合附图1对本发明作进一步详细说明。

实施例一：培养1亿个脂肪间充质干细胞分泌素一

取2百万个间充质干细胞置于含有完全培养基I中的，并将培养基置于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度孵箱中，过夜后翻转，以此培养出1.5千万个脂肪间充质干细胞；然后将上述脂肪间充质干细胞转移至有5g微载体和600毫升完全培养基I的4升生物反应器中。生物反应器内部的温度为37℃，且含有体积分数为5％的CO₂，并保持湿度为饱和状态，转速维持于50rpm。同时，每隔24小时向生物反应器中加入100毫升新鲜的完全培养基I，持续细胞培养至脂肪间充质干细胞数目到达1亿个的水平(总共约需8天)；

当脂肪间充质干细胞数目达标时利用含双抗的PBS缓冲液对脂肪间充质干细胞及其附着的微载体清洗三次，生物反应器中注入3升含双抗的PBS缓冲液及1升完全培养基I，继续培养，每隔24小时加入150毫升新鲜的完全培养基I，于72小时后收集生物反应器中的上清液；

利用0.22um的滤膜过滤上清液以除去当中残余的脂肪间充质干细胞并获得一次滤液，然后向一次滤液中加入PCH絮凝剂使得蛋白质发生沉淀，这里PCH絮凝剂占一次滤液的质量分数为0.3％。将一次滤液和蛋白质沉淀一起倒至1mm的滤纸上进行过滤，同时也可以根据需要多张滤纸叠加进行使用。之后，用去离子水将滤纸上的蛋白质沉淀全部冲至滤孔为5kDa的半透膜内，然后用去离子水对蛋白质沉淀进行冲洗，从而将蛋白质与PCH絮凝剂、高盐分及完全培养基I进行分离，得到纯净的蛋白质溶液，纯净的蛋白质溶液经过加热至68～70℃，并保持此温度30min以后急速冷却到4～5℃进行消毒。

此时，纯净的蛋白质溶液再利用冷冻干燥机制成粉末并保存于2～8度，得到脂肪间充质干细胞分泌素成品，这里通过SDS-PAGE凝胶电泳对所获得的脂肪间充质干细胞分泌素进行检测，得到脂肪间充质干细胞分泌素的纯度可以达到98.7％，而且脂肪间充质干细胞分泌素的损失率仅为0.5％。

另外，这里所使用的完全培养基I为含体积分数为1％胎牛血清、含体积分数为35％MCDB201、7μg/L血小板衍生生长因子、8μg/L碱性成纤维细胞生长因子、5μg/L表皮生长因子的DF12培养基。

并且在完全培养基I中加入碳酸氢钠，调整完全培养基I的pH值为7.2～7.4。

实施例二：培养1亿个脂肪间充质干细胞分泌素二

本实施例二与实施例一的区别在于，当脂肪间充质干细胞数目达标时利用含双抗的PBS缓冲液对脂肪间充质干细胞及其附着的微载体清洗三次，生物反应器中注入5升含双抗的PBS缓冲液及1升完全培养基I，继续培养，于72小时后收集生物反应器中的上清液；而且这里的PCH絮凝剂所占一次滤液的质量分数为0.5％；再者，完全培养基I的配方为含体积分数为3％胎牛血清、含体积分数为45％MCDB201、13μg/L血小板衍生生长因子、12μg/L碱性成纤维细胞生长因子、15μg/L表皮生长因子的DF12培养基。

从而所得到的脂肪间充质干细胞分泌素的纯度可以达到99.1％，损失率为0.7％。

实施例三：培养1亿个脂肪间充质干细胞分泌素三

本实施例三与实施例一的区别在于，当脂肪间充质干细胞数目达标时利用含双抗的PBS缓冲液对脂肪间充质干细胞及其附着的微载体清洗三次，生物反应器中注入4升含双抗的PBS缓冲液及1升完全培养基I，继续培养，于72小时后收集生物反应器中的上清液；而且这里的PCH絮凝剂所占一次滤液的质量分数为0.4％；再者，完全培养基I的配方为含体积分数为2％胎牛血清、含体积分数为40％MCDB201、10μg/L血小板衍生生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L表皮生长因子的DF12培养基。

从而所得到的脂肪间充质干细胞分泌素的纯度可以达到98.8％，损失率为0.4％。

实施例四：培养1亿个牙髓间充质干细胞分泌素一

本实施例四与实施例一的区别在于，只是利用牙髓间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，于4升生物反应器中的生长时间可由总时间8天减少至6天。从而所得到的脂肪间充质干细胞分泌素的纯度可以达到98.4％，损失率为0.8％。

实施例五：培养1亿个牙髓间充质干细胞分泌素二

本实施例五与实施例二的区别在于，只是利用牙髓间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，于4升生物反应器中的生长时间可由总时间8天减少至6天。从而所得到的脂肪间充质干细胞分泌素的纯度可以达到98.8％，损失率为0.9％。

实施例六：培养1亿个牙髓间充质干细胞分泌素三

本实施例六与实施例三的区别在于，只是利用牙髓间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，于4升生物反应器中的生长时间可由总时间8天减少至6天。从而所得到的脂肪间充质干细胞分泌素的纯度可以达到90.0％，损失率为0.6％。

实施例七：培养1亿个脐带间充质干细胞分泌素一

本实施例七与实施例一的区别在于，只是利用脐带间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，于4升生物反应器中的生长时间可由总时间8天延长至10天，在培养过程中每隔72小时更换一下生物反应器中的培养液。从而所得到的脐带间充质干细胞分泌素的纯度可以达到99.1％，损失率为1.0％。

实施例八：培养1亿个脐带间充质干细胞分泌素二

本实施例八与实施例二的区别在于，只是利用脐带间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，于4升生物反应器中的生长时间可由总时间8天延长至10天，在培养过程中每隔72小时更换一下生物反应器中的培养液。从而所得到的脐带间充质干细胞分泌素的纯度可以达到99.4％，损失率为1.3％。

实施例九：培养1亿个脐带间充质干细胞分泌素三

本实施例九与实施例三的区别在于，只是利用脐带间充质干细胞代替脂肪间充质干细胞，于4升生物反应器中的生长时间可由总时间8天延长至10天，在培养过程中每隔72小时更换一下生物反应器中的培养液。从而所得到的脐带间充质干细胞分泌素的纯度可以达到99.2％，损失率为0.8％。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。