一株假单胞菌及其应用的制作方法

本发明属于有益菌筛选技术领域，具体涉及一株假单胞菌及其应用。

背景技术：

磷元素是植物生长所需的一种主要营养元素之一，土壤中的磷主要以难溶性的磷酸盐形式存在。为了提高农产品的产量，人们长期大量施用磷肥。但磷肥在施用后很快就被固定形成无效态磷，变得不可利用，造成了作物的低吸收和磷元素在土壤中的大量积累；因此提高土壤中磷的利用率一直是农业科技工作者研究的热点课题之一。土壤中存在着一些微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的状态，这些微生物称为解磷菌。解磷菌分为两种，分别是解无机磷细菌和解有机磷细菌。解无机磷细菌的主要作用是分解无机磷化物，如磷酸钙、磷灰石等，其作用机理是借助细菌生命活动过程中所产生的酸溶解无机磷；解有机磷细菌的主要作用是分解有机磷化物，如核酸、磷脂等，其作用机理主要是借助于细菌生命活动中所产生的酶分解有机磷。目前国内外对解无机磷菌的筛选已有一些报道。然而由于解有机磷菌在应用中的促生效果不明显、促生作用不稳定等，使得解有机磷菌尚未实现大规模的应用和商业化生产。本发明拟从环境中筛选促生效果显著、促生作用稳定的高效有机磷降解菌，推动有机磷降解菌的大规模应用和商业化生产，并促进我国农业的绿色、可持续发展。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株假单胞菌，即一具有高效解有机磷的假单胞菌及其在促进植物生长方面的应用。

本发明首先提供一株从天津草坪根周土壤中分离的假单胞菌(Pseudomonas sp.)C3-6株，其于2016年8月15日，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.12836。

上述的假单胞菌C3-6用于制备微生物肥料：

所述的菌株具有较好的解有机磷作用。

所述的菌株还可以用于合成吲哚乙酸。

所述的菌株还可以用于合成铁载体。

所述的菌株在制备促植物生长的制剂的应用。

所述的制剂为促磷元素吸收的制剂、促吲哚乙酸合成的制剂、促铁载体合成的制剂中的一种或几种。

所述的制剂为微生物菌剂或微生物肥料。

本发明提供的假单胞菌C3-6，是以卵黄作为唯一磷源的培养基从天津草坪根周土壤中筛选获得的，16S rDNA序列测定结果表明该菌是一种假单胞菌，分类命名为Pseudomonas sp.C3-6。

本发明提供的假单胞菌C3-6，由于其能将土壤中不溶性的有机磷磷转换为可被植物直接吸收、利用的有效磷，因而可促进作物生长。

本发明提供的假单胞菌C3-6，还能够合成吲哚乙酸和铁载体，但是不具有解无机磷、解钾、固氮、拮抗病原菌的能力。

本发明提供的假单胞菌C3-6可显著促进黄瓜苗的生长。盆栽实验表明，与空白对照相比，假单胞菌C3-6可提高黄瓜苗鲜重71.53％、干重69.78％、株高33.55％；与阳性对照枯草芽孢杆菌FH1相比，可提高黄瓜苗鲜重2.52％、干重21.14％和株高8.27％。

附图说明

图1：假单胞菌C3-6在LB平板(A)、解有机磷平板(B)和CAS平板(C)上的生长形态。

图2：假单胞菌C3-6对黄瓜苗干重、鲜重和株高的影响图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，本领域的普通技术人员在本发明公开内容的基础上可以选择本领域其它常用的方法来替代说明书具体实施例中采用的方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、解有机磷菌C3-6的分离和鉴定

1、解有机磷菌C3-6的分离

解有机磷菌C3-6的分离包括取样、筛选和纯化两个步骤，具体方法如下：

1.1、取样

样品采集于天津中国科学院天津工业生物技术研究所院内的草坪根周土壤。

1.2、筛选和纯化

称取1g土壤样品，置于9ml无菌水中高速震荡制成土壤菌悬液，将梯度稀释的土壤悬液涂布在有机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH)₂SO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂0 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂0 0.03g，MnSO₄·H₂O 0.03g，CaCO₃ 5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.0～7.5。将培养基融化冷却至50℃后，立即加入蛋黄液(蛋黄液为0.8％无菌生理盐水与鸡蛋黄1:1配制)，每100mL的基础培养基加卵黄稀释液3～4mL作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板)上，倒置于生化培养箱中30℃培养7天。挑取平板上透明圈较明显的菌落在有机磷固体培养基上进行重复划线分离纯化，得到单一菌落。

2、解有机磷菌C3-6的鉴定

对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA提取，16S rDNA的扩增和测序。

2.1该菌株在LB培养基上为乳白色菌落，表面光滑，菌落边缘整齐。革兰氏染色为阴性。结果如图1A所示。

2.2利用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)对解有机磷菌C3-6的16S rDNA进行扩增：

PCR反应体系为25μL，具体成分如下：

PCR扩增条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对，结果表明，解有机磷菌C3-6与Stenotrophomonas sp.的相似度为100％，覆盖度为99％。

将上述获得的纯培养菌株中的一株命名为假单胞菌C3-6，并将其保藏。保藏时间：2016年8月15日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC；保藏号为CGMCC NO.12836。

实施例2、假单胞菌C3-6的解有机磷能力测定

将假单胞菌C3-6在牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养1～2d后，用移液枪吸取5μL接种到有机磷固体培养基上，30℃培养7天，测量溶磷圈直径(HD)和菌落直径(CD)。

结果如图1B所示，假单胞菌C3-6在有机磷固体培养基平板上形成了较明显的溶磷圈，HD/CD值为3.28。说明CGMCC NO.12836具有将土壤中的难溶性有机磷，转换成易于吸收的有效磷的能力，这可使植物更易于吸收磷，从而促进植物生长。

实施例3、假单胞菌C3-6分泌生长激素吲哚乙酸(IAA)的能力测定

将假单胞菌C3-6接种到King培养基(蛋白胨20g，甘油15mL，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄·7H₂0 1.5g，色氨酸0.1g，pH 7.2(用KOH调PH))中，30℃，200rpm摇床培养24h。取3mL菌液12000rpm离心15min。取1mL的上清液加入2mL的Salkowski's反应液(12mg/L FeCl₃，7.9mol/L H₂SO₄，加蒸馏水至1L)，混匀，在暗处反应30min后，在紫外分光光度计上选择波长530nm测吸光度值。无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、5、10、20、30、40、50、60μg·mL^-1的IAA标准溶液同方法做标准曲线。每个样品设置3个重复。

根据制作标准曲线和检测结果，即可获得假单胞菌C3-6分泌吲哚乙酸(IAA)的量为9.81μg/mL。假单胞菌C3-6以色氨酸(L-Trp)为前体合成植物生长激素吲哚乙酸(IAA)，由于其吸附在种子和根的表面，从而被植物所利用，同时也可以和植物内生的IAA共同作用刺激植物细胞生长和增殖，可促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分，同时对植物的其他生命活动进行调节。

实施例4、假单胞菌C3-6分泌铁载体能力测定

铬天青(chrome azurol S，CAS)培养基的配制：

A：蓝色染液

a.0.06g CAS溶于50ml去离子水；

b.0.0027g FeCl·6H₂O溶于10ml 10mM HCl；

c.0.073g HDTMA(十六烷基三甲基溴化胺)溶于40ml去离子水；

d.将a与9ml b混合，再混合c，此时为蓝色，121℃高温灭菌20min。

B：混合液

a.MM9：15g KH2PO4，25g NaCl，50g NH4Cl溶于500ml去离子水；

b.20％葡萄糖溶液：20g葡萄糖溶于100ml去离子水，110℃单独灭菌，；

c.NaOH溶液：25g NaOH溶于150ml去离子水，pH约为12；

d.水解酪蛋白物溶液：3g酪蛋白水解物溶于27ml去离子水，滤膜过滤。

C：CAS琼脂板准备(1L量)：

a.100ml MM9加入750ml去离子水；

b.溶解32.24g哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES)；

c.加入细菌培养用琼脂15g；

d.高温灭菌(121℃，20min)，冷却到50℃；

e.加入30ml过滤灭菌的水解酪蛋白溶液，10ml 20％的葡萄糖溶液到MM9/PIPES混合液中(6ml+2ml)；

f.缓慢加入100ml蓝色染液，沿玻璃瓶壁加入，充分混匀；

g.倒平板。将已分离保存的细菌接于铬天青(CAS)培养基上，28℃培养48～72h，观察菌落周围的颜色变化，以及产生的橘黄色的透明晕圈的直径。

将假单胞菌C3-6接于CAS固体培养基上，28℃培养72h，观察菌落周围的颜色变化，有橘黄色圈产生即可产生嗜铁素。

结果如图1C所示，在CAS固体培养基上，假单胞菌C3-6菌落周围有橘黄色晕圈产生，即假单胞菌C3-6具有产生铁载体的能力。说明CGMCC NO.12836具有吸收土壤中铁的能力，这可能会抑制某些病原菌，从而促进植物生长。

实施例5、假单胞菌C3-6的固氮能力测定

将假单胞菌C3-6在牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养24h，吸取5μL菌液点接在阿须贝固氮培养基(磷酸二氢钾0.2g，七水硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙5.0g，甘露醇10.0g，二水硫酸钙0.1g，琼脂粉20g，蒸馏水1L，pH 7.0。)上，30℃静置培养3天，观察是否有菌落形成。如果可在阿须贝固体培养基上生长，则具有固氮能力，反之，则无固氮能力。

结果表明假单胞菌C3-6在阿须贝固体培养基上无生长，说明其不具有固氮能力。

实施例6、假单胞菌C3-6的解无机磷能力测定

将假单胞菌C3-6在牛肉膏蛋白胨液体培养基中摇床培养24h，吸取5μL菌液点接在解无机磷培养基(磷酸二氢钾0.2g，七水硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙5.0g，甘露醇10.0g，二水硫酸钙0.1g，琼脂粉20g，蒸馏水1L，pH 7.0。)上，30℃静置培养3天，观察菌落是否生长，有无透明圈形成。

结果表明假单胞菌C3-6在解无机磷固体培养基上无透明圈形成，说明其不具有固氮能力。

实施例7、假单胞菌C3-6对黄瓜苗的促生效果

采用盆栽试验进行黄瓜苗的促生实验。供试土壤为天津市空港经济区土壤，土壤性质：有机质3.37％；全氮194mg/kg，全磷810mg/kg，全钾8897mg/kg；速效氮77.42mg/kg；速效磷45.70mg/kg；速效钾101.17mg/kg；pH 8.23)。供试作物为黄瓜(津优一号)，将黄瓜种子浸种发芽，在苗床中育种5天后，选取大小一致的植株作为实验植株。供试菌株为解有机磷效果较好且有差异的解有机磷细菌。阳性对照为枯草芽孢杆菌FH1。细菌接种量为1×10⁸CFU/g土壤。

将解有机磷菌在人工气候培养箱中进行黄瓜盆栽实验，从而筛选出对黄瓜有促生作用的高效解有机磷菌。首先将300g供试土壤装入直径为8cm的花盆中，每个花盆中移栽2株黄瓜苗。将在牛肉膏蛋白胨培养基中培养36h的假单胞菌C3-6进行离心(5000×g，7min，10℃)，用0.9％生理盐水冲洗3次，收集菌体，用无菌蒸馏水稀释到浓度为3×10¹¹CFU/mL的菌悬液。每个花盆中添加100mL菌悬液，每个处理10个重复。等量蒸馏水处理作为空白对照。将黄瓜放置于人工气候培养箱中进行培养(28℃，9h光照，17℃，16h无光照，湿度为75％)，并进行统一管理(每48h浇水30mL)，培养35d。实验结束后，对黄瓜苗的茎高、根长、茎鲜重、根鲜重、茎干重及根干重进行测量。

检测结果表明，假单胞菌C3-6活菌对黄瓜苗具有显著的促生作用，与空白对照相比，假单胞菌C3-6可提高黄瓜苗鲜重71.53％、干重69.78％、株高33.55％；与阳性对照枯草芽孢杆菌FH1相比，可提高黄瓜苗鲜重2.52％、干重21.14％和株高8.27％。

表1假单胞菌C3-6对黄瓜茎鲜重、根鲜重及植株鲜重的影响

表2假单胞菌C3-6对黄瓜茎干重、根干重及植株干重的影响

表3假单胞菌C3-6对黄瓜茎高、根长及植株高的影响

综上检测表明，CGMCC NO.12836可溶解土壤中的不溶性有机磷磷为有效磷，可促进植物对磷元素的吸收，进而促进植物生长；尤其是还能够合成吲哚乙酸和铁载体，提供吲哚乙酸和铁载体促进植物生长。此外盆栽实验也表明其具有较强的促生能力，且优于枯草芽孢杆菌。因此，由于上述作用所具有的促植物生长的共性，所以虽然该菌从草坪根周土壤中分离，但是该菌能够作为一种广泛的促生菌应用于其他植物促生长当中。