本发明涉及微生物领域筛选生产特定产物的新菌株的方法，具体涉及一种具有细菌纤维素高生产能力的细菌菌株的筛选方法
背景技术：
细菌纤维素(bacterial cellulose，简称BC)是一种由革兰氏阴性产酸菌合成的、优良天然可降解纤维素，通常指由醋酸菌属(Acetobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等微生物，在不同条件下合成的纤维素的统称。BC和植物等产生的天然纤维素具有相同的分子结构单元，都是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的高分子化合物，但细菌纤维素却有许多更加优异的性质：具有巨大的表面积、较高持水率和压缩性能，高抗张强度；微纤维直径约为0.1μm，比木质纤维小300倍【S.S.Kim，S.Y.Lee，K.J.Park，et al.Saudi Journal of Biological Sciences，2015】；高纯度高结晶度；较高的生物相容性和良好的生物可降解性；合成时可调控性等等。因此BC已被广泛应用于食品添加、包装材料、造纸、生物医药、声学器材等诸多领域【卢美欢，马英辉，王银存等.中国酿造，2013，32(7)：46-49】。
以椰子水等为原料筛选产BC菌株起步较早，发展较为迅速，利用椰子水的高营养成分进行产BC菌株的优化培养以提高产量的研究均已发展较为成熟。随着近年来椰子系列产品在食品市场上占据越来越多的份额，而椰子原产地在我国地域上十分受限，导致椰子的成本呈逐年递增趋势，除此之外，不同的椰子水，同样的产纤维培养基配方，纤维素产量差异较大【王志国，钟春燕，王锡彬等.中国酿造，2009，4：32-34】，经济上不利于发展BC的研究和生产工作。于是学者们将目光扩至营养丰富、来源广泛的营养源上。在此方向上，学者们日渐探索出一些用其他原料筛选细菌纤维素的方法。利用一些天然原料，如水果类原料、糖质原料、低值淀粉类原料和废弃纤维素类原料等均被用来尝试作筛选产BC菌株的原料【谢健健，洪枫.纤维素科学与技术，2011，19(3)：68-74】。利用一些发酵生产废水，如酒糟废水、酿醋废水【JM Wu，RH Liu.Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115(3)：284-290】或者农林废弃物及副产物【杨光，王彩霞.纤维素科学与技术，2015，(23)4：67】等作为筛菌原料，既能充分利用废弃有机物质中所含的丰富的碳源等成分，又在一定程度上缓解由于大量弃埋所形成的固体有机污染物垃圾以及生产污水排放污染，充分体现绿色环保的可持续原则。考虑到我国水果物产丰富，且水果的生产具有明显的季节性变化，容易发生水果大量腐败而丢弃处理的浪费现象，选取腐败水果作筛选产BC菌株的原料来源【周胜虎，薛齐佳，刘传凤等.湖北农业科学，2013，52(15)：3514-3517】，成为深具潜力的发展趋势。
自然筛选得到的产BC菌株的产量往往较低，相对于培养基成本其经济性较差，提高菌株产BC的能力成为迫切需要。研究者们关于BC的生产方式分别以静态培养与动态培养两种方式做了大量对比研究【朱宏阳，冯珊，杨宏芳等.海峡药学，2015，27(12)：265-268】，分别能满足不同的产品需求；常用单因素实验、正交试验【张雯，葛万云，齐香君.食品研究与开发，2015，36(18)：106-110】以及响应面法【周莲，卢红梅，陈莉等.中国调味品，2016，41(2)：69-73】等来确定产细菌纤维素菌株的最佳碳氮源与培养基【Faranak Mohammadkazemia，Mehrdad Azinb，Alireza Ashoric.Carbohydrate Polymers，2015，117：518-523】等最优生产条件。除此之外，等离子体注入诱变【张桂才，贾士儒，闫林等.现代食品科技，2010，26(12)：1354-1357】、紫外线与硫酸二乙酯复合诱变【张银冰.食品工程，2014，2：42-45】【邓毛程，李静，王瑶等.食品工业科技，2015，36(4)：159-162】、高静水压处理诱变【林德慧，杜双奎，李志西等.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2011，39(3)：119-124】、低能N+离子束辐照诱变【张雯，李成涛，李彦军等.现代食品科技，2015，31(5)：144-149】、紫外低温复合诱变【王良等.生物化工，2016，2(2)：20-25】等方法，被应用到提高菌株产BC能力的研究中，均取得一定的积极成果，但也存在很多不足之处亟待改善。等离子体注入法诱变机制复杂，尚未全部被掌握，随之可能发生诱变菌株最优生产条件的改变，在实践应用上带来很大的不确定性；紫外诱变的操作要求严苛，必须在暗处进行，否则容易发生光修复使诱变效率低下；高静水压处理法对菌株的诱变方向不明确从而难以掌控，存在可能改变菌株的某些正常遗传物质而导致其他生理性状的改变。诱变的方法普遍存在结果随机性较大的不足之处，正向突变率极低导致工作量的增大，致使总的工作效率低下；大多的诱变操作不能保证传代和遗传的稳定性，导致菌株产量波动较大，甚至会渐渐失去高产的优异性质，反而进一步增大生产成本；诱变法在实现BC产量提高的同时，可能导致菌株其他性能的变化以至于不再符合实际生产的需求。诱变法所得的高产菌株即使是在实验室规模中取得较好的进步，其高产性能以及经济性在中试以及实际生产应用中仍面临巨大的挑战。因此，采取有效的方法，从自然环境中直接筛选性能优良的BC高产菌株尤为必要。目前已有不少研究者尝试从不同菌源做产BC菌株的筛选，并对其培养条件做了优化【王雪奇，应以坚，金亚倩等.轻工科技，2015，(11)：6-8】，但是成功筛选出高产BC菌株的实例仍屈指可数，且生产成本仍居高不下。筛选高产BC菌株的方法还有待深入研究。本发明提供一种具有BC高生产能力的细菌菌株的筛选方法，该方法从自然接种于空气的富含丰富营养成分以及微量元素的腐败水果中或从天然土壤中，进行BC高产菌株的筛选。该方法无额外引入繁杂的操作，低廉有效，并且从自然中取材，不产生任何污染，操作周期简短，便于大规模的应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种筛选具有BC高生产能力菌株的方法，具体步骤包括：
菌株来源于自然接种的腐败水果或土壤，把土样悬浮液及水果破碎过滤后稀释的滤液接种至富集培养基中，30℃，150～200r/min振荡培养24h，将制得的菌悬液10倍梯度稀释后，选择3个合适稀释倍数的菌悬液各100～200μL，涂布在表面含有碳酸钙层的分离培养基上，每种稀释浓度各2～3个平行样，30℃，pH＝6.8～7.0培养3～5d。挑取周边有透明区域的菌落划线培养，得到纯菌单菌落。接种单菌落于HS发酵培养基，27～31℃，pH＝3.5～7.0，120～180r/min培养2～14d，将能够产生凝胶状物质的菌株进行斜面保存备用。
本发明的优势在于：1.筛菌原材料取自菌种含量丰富且广泛易得的土壤、营养丰富却极易腐败而导致大量有机固体垃圾、恶臭产生的水果。土壤是微生物的物种库，为此类筛菌工作提供了极大的可行性，土壤的取材简便易行，且随取材地的不同提供不同种类优良性状的菌种。水果养分富裕但储存运输条件要求苛刻而容易腐败，取材自腐败的水果起到废物利用的作用，充分发挥水果营养高的特点，体现绿色环保的发展规律。两种材料皆成本低廉，广泛易得，且利于菌种的富集。
2.本课题组采用该发明方法从自然接种于空气的腐败水果中或从天然土壤中进行高产BC菌株的筛选，并且取得了较理想的成果。该方法所筛出的产BC菌株产酸量明显高于市场上购得的产BC菌株-木醋杆菌，并且产量也有很大幅度的提升。经扫描电镜图像明显看出，该方法所筛出的产BC菌株分子结构、孔隙度等性能与市场所售木醋杆菌所产细菌纤维素存在明显差异。
下面结合具体实例对本发明做进一步说明。
实施例1.制定筛选方案
实验材料来自各处采集的土样以及腐败的苹果、梨、西瓜、柑橘类、哈密瓜等10余种水果的果皮与果肉、茶水等。将采集的样品分别进行预处理后，将其中或表面所含的菌种全部溶解在水中，制得菌悬液。将制得的菌悬液按梯度稀释后选择若干合适稀释倍数的菌悬液进行稀释涂布，用本课题组自制的分层的分离培养基上，培养出茂盛的菌落后，挑取周边有透明区域的菌落反复纯化划线培养，得到产酸单菌落。将所筛得的产酸菌接种至斜面培养基保存于冰箱。待用时从冰箱中取出斜面培养基先后接种至常温下的保存培养基、种子活化液体培养基进行菌株复活。将活化后的种子液接入HS发酵培养基分别进行动态、静态培养，对能够产生凝胶状物质的菌株作深度测试表征。
实施例2.不同培养基及溶液配方方案
(1)富集培养基：酵母粉5g，蛋白胨3g，甘露醇25g，蒸馏水1000ml。pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)分离培养基：葡萄糖20g，蛋白胨8g，酵母粉5g，轻质碳酸钙7g，琼脂粉12g，蒸馏水1000ml，pH＝6.8～7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却到50℃后加无水乙醇5ml。
(3)斜面保存培养基：葡萄糖20g，蛋白胨8g，酵母粉5g，琼脂粉12g，蒸馏水1000ml。分装后121℃高压蒸汽灭菌20min。
(4)HS发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母粉5g，柠檬酸1.15g，磷酸氢二钠4g，蒸馏水1000ml。pH＝3.5～7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却到50℃后加无水乙醇20ml。
(5)种子活化培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，K2HPO41g，MgSO415g，蒸馏水1000ml。pH自然、121℃高压蒸汽灭菌20min；冷却到50℃后加无水乙醇20ml。
实施例3.土壤样品产BC菌株的筛选与保存
(1)菌悬液的制备：实验材料来自各处采集的土样进行预处理，去除其中的粗砾杂草根等杂物质，称取10g左右经预处理的土样，用无菌水溶解于小烧杯，用玻璃棒充分搅拌，确保土样中的菌种全部溶解在水中，对土样悬浊液进行抽滤至烧杯中，可将过滤后的滤液进行适当稀释。将土样抽滤后的滤液接种至已灭菌处理的富集培养基中，30℃，200r/min振荡培养24h，制得土样菌悬液。
(2)稀释涂布培养：将制得的土样菌悬液按10倍梯度稀释后选择合适稀释倍数，如10-6、10-7、10-8倍的菌悬液各100μL，涂布在已灭菌处理具有产酸菌筛选层的碳酸钙分离培养基上，每种稀释浓度各3个平行样，在已除菌的超净台中30℃培养3d，挑取周边有透明区域的菌落反复纯化划线培养，得到产酸单菌落。每一株产酸菌单独标记并接种至斜面保存培养基，置于无菌超净台内生长至菌落茂盛后，转移至-4℃冰箱中保存菌种。
(3)低温保存的产酸菌株的活化：从冰箱中保存的斜面培养基接种菌株至新的已灭菌处理的斜面培养基，置于无菌超净台内生长至菌落茂盛。
(4)种子液的制备：于活化的斜面试管培养基中接种2～3环菌苔，接种至已灭菌处理的种子活化液体培养基。30℃，130r/min振荡培养24h。
(5)产凝胶状产物菌株的筛选：以10％的接种量，将活化后的种子液接入已灭菌的装有100mLHS发酵培养基的250mL广口瓶中，或直接接种产酸菌单菌落2～3环于已灭菌处理的HS发酵培养基，8层纱布封口后，分别进行动态、静态培养：静态培养于超净台内室温静置培养5d；动态培养为30℃，180r/min培养2d。将能够产生凝胶状物质的菌株留用。
实施例4.水果产BC菌株的筛选与保存。
(1)菌悬液的制备：实验材料来自各种腐败的苹果、梨、西瓜、柑橘类、哈密瓜等10余种水果的果皮与果肉。将采集的腐败水果样品进行预处理，称取10g左右经预处理的样品，完全破碎后用无菌水冲洗至小烧杯，用玻璃棒充分搅拌，确保土样中的菌种全部溶解在水中，将适当稀释过滤后的滤液接种至已灭菌处理的富集培养基中，30℃，150r/min振荡培养24h，水果样品制得菌悬液。
(2)稀释涂布培养：将制得的水果样品菌悬液按10倍梯度稀释后选择3个合适稀释倍数的菌悬液，如10-7、10-8、10-9倍的，各150μL，涂布在已灭菌处理具有产酸菌筛选层的碳酸钙分离培养基上，每种稀释浓度各3个平行样，在已除菌的超净台中30℃培养4d，挑取周边有透明区域的菌落反复纯化划线培养，得到产酸单菌落。每一株产酸菌单独标记并接种至斜面保存培养基，置于无菌超净台内生长至菌落茂盛后，转移至-4℃冰箱中保存菌种。
(3)低温保存的产酸菌株的活化：从冰箱中保存的斜面培养基接种菌株至新的已灭菌处理的斜面培养基，置于无菌超净台内生长至菌落茂盛。
(4)种子液的制备：于活化的斜面试管培养基中接种2～3环菌苔，接种至已灭菌处理的种子活化液体培养基。30℃，130r/min振荡培养24h。
(5)产凝胶状产物菌株的筛选：以10％的接种量，将活化后的种子液接入已灭菌的装有100mLHS发酵培养基的250mL广口瓶中，或直接接种产酸菌单菌落2～3环于已灭菌处理的HS发酵培养基，8层纱布封口后，分别进行动态、静态培养：静态培养于超净台内室温静置培养7d；动态培养为30℃，180r/min培养7d。将能够产生凝胶状物质的菌株留用。
实施例5.茶水样品产BC菌株的筛选与保存
(1)菌悬液的制备：实验材料来自各种用无菌水浸泡茶叶所得茶水等进行过滤等预处理，去除其中的固体物质，充分浸泡出茶水中营养以及确保菌种全部溶解在水中，称取10ml左右经预处理的茶水于小烧杯，对茶水液进行适当稀释。将稀释后的滤液接种至已灭菌处理的富集培养基中，30℃，200r/min振荡培养24h，制得茶水样菌悬液。
(2)稀释涂布培养：将制得的茶水样菌悬液按10倍梯度稀释后选择合适稀释倍数，如10-6、10-7、10-8倍的菌悬液各200μL，涂布在已灭菌处理具有产酸菌筛选层的碳酸钙分离培养基上，每种稀释浓度各3个平行样，在已除菌的超净台中30℃培养5d，挑取周边有透明区域的菌落反复纯化划线培养，得到产酸单菌落。每一株产酸菌单独标记并接种至斜面保存培养基，置于无菌超净台内生长至菌落茂盛后，转移至-4℃冰箱中保存菌种。
(3)低温保存的产酸菌株的活化：从冰箱中保存的斜面培养基接种菌株至新的已灭菌处理的斜面培养基，置于无菌超净台内生长至菌落茂盛。
(4)种子液的制备：于活化的斜面试管培养基中接种2～3环菌苔，接种至已灭菌处理的种子活化液体培养基。30℃，150r/min振荡培养24h。
(5)产凝胶状产物菌株的筛选：以10％的接种量，将活化后的种子液接入已灭菌的装有100mLHS发酵培养基的250mL广口瓶中，或直接接种产酸菌单菌落2～3环于已灭菌处理的HS发酵培养基，8层纱布封口后，分别进行动态、静态培养：静态培养于超净台内室温静置培养14d；动态培养为30℃，180r/min培养14d。将能够产生凝胶状物质的菌株留用。