一种在水稻分蘖芽基部和穗特异表达的启动子的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种在水稻分蘖芽基部和穗特异表达的启动子的应用。

背景技术：

在植物生长所需各种大量元素中，氮素是植物生长中需求量最大且起着制约作用的重要元素，是限制植物生长和植物产量的首要因素，同时，氮素也是生态系统中最常见的限制性因子[剧成欣，张耗，王志琴，等.水稻高产和氮肥高效利用研究进展[J].中国稻米，2013，19：16-21.]。适当增加氮肥施用量是使作物获得高产的主要措施之一，然而氮肥利用率低以及随着人们大量的施用氮肥，造成大量氮素的损失。由于氮对大气和水体的排放，对环境带来了一系列令人堪忧的问题，继而对生态平衡造成不同程度的破坏。因而，提高农作物对氮素的吸收和再利用效率，不仅可以为今后的研究提供理论依据，对提高农作物产量和减少生态环境的污染也具有重要意义。

随着分子生物学和基因工程在植物领域的迅速发展，植物对氮素吸收转运的分子机理也越来越清晰。根据前人的探究表明，氮的运输蛋白主要分为氨基酸运输蛋白、寡肽运输蛋白、嘌呤及嘌呤衍生物运输蛋白、铵根运输蛋白和硝酸根运输蛋白(NRT1)五大家族。寡肽运输基因家族分为运输含2～3个氨基酸残基的寡肽的PTR运输基因家族(peptide transporter family,PTR)和运输4～5个氨基酸残基的寡肽的OPT运输基因家族(oligopeptide transporter family,OPT)两大类[蔡昭艳，刘滔，方中明，等.植物寡肽运输与硝酸根运输基因家族的研究进展[J].热带亚热带植物学报，2011，19(1)：91-96.]。其中NRT1与PTR在序列同源性上归属于同一基因家族NPF(NRT1/PTR,nitrate transporter 1/peptide tansporter 1)家族，即能够介导硝酸根、2-3个氨基酸的小分子肽等物质进行跨膜运输的蛋白[Rentsch D,Schmidt S,Tegeder M.Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds in plants.FEBS Let,2007,581:2281-2289.]。

水稻中有84个NPF同源基因，但这些基因家族成员的功能和作用目前还知之甚少，只有少数几个基因已经报道。有研究发现SP1(OsNPF4.1)基因编码一个属于PTR家族的硝酸盐转运蛋白，决定水稻穗长[Li SB,Qian Q,Fu ZM,et al.Short panicle1encodes a putative PTR family transporter and determines rice panicle size.The Plant J,2009,58(4)：592-605.]；OsPTR9(OsNPF8.20)的表达受外源氮和昼夜节律调节，改变OsPTR9的表达影响水稻的氮素利用效率、生长和产量[Fang ZM,Xia KF,Yang X et al.Altered expression of the PTR/NRT1 homologue OsPTR9 affects nitrogen utilization efficiency,growth and grain yield in rice.Plant Biotech J,2013,11(4)：446-458.]。NPF基因家族其他成员的时空表达特异性并不清楚。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种在水稻分蘖芽基部和穗中特异性表达的水稻NPF基因家族成员OsNPF7.4基因的启动子的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的NPF基因家族成员OsNPF7.4基因的启动子为对象，首先将构建好的启动子-GUS表达载体通过农杆菌介导转化到水稻成熟胚诱导的愈伤组织中，得到转基因植株后鉴定阳性植株，继而得到T1代转基因植株，得到T2代成熟种子。然后在T2代种子生长的不同时期分别进行GUS组织化学染色，分别对其植株的根、茎、叶、穗等不同组织进行染色，检测GUS表达活性，分析其时空表达特异性。结果发现该启动子是一个在水稻分蘖芽长出的基部和穗中特异表达的启动子，能够启动下游基因在水稻分蘖芽基部和穗中特异性表达，该启动子的表达部位与水稻产量的重要性状分枝(分蘖和穗分枝)关系密切。将该启动子应用于转基因工程中，可在水稻营养生长阶段促进分蘖芽的伸长或目的基因在分蘖芽基部的表达积累；同时，也可在水稻生殖生长阶段促进穗灌浆结实或目的基因在穗部的表达积累。因此，OsNPF7.4基因的启动子在转基因工程中有良好的应用前景。

一种OsNPF7.4基因的启动子在水稻中的应用，为该启动子能够启动下游基因在水稻分蘖芽基部和/或穗中特异性表达。实现该应用的方法具体包括如下步骤：构建该启动子-目的基因的表达载体，再将表达载体导入水稻中得到转基因水稻，目的基因能够在水稻分蘖芽基部和/或穗中特异性表达，达到增加目的基因局部表达量的目的。

所述的启动子的序列如SEQ ID NO.1所示，或为对SEQ ID NO.1所示的序列进行取代、添加和/或缺失一个或几个核苷酸获得的不影响下游基因表达、具有同等功能的DNA序列。

所述的表达载体的骨架载体优选为pCAMBIA-1301载体。

本发明发现了OsNPF7.4基因的启动子能启动其下游基因在水稻分蘖芽基部和穗中特异性表达。将该启动子应用于转基因工程中，可在水稻营养生长阶段促进分蘖芽的伸长或目的基因在分蘖芽基部的表达积累，也可在水稻生殖生长阶段促进穗灌浆结实或目的基因在穗部的表达积累，有良好的应用前景。

附图说明

图1是启动子-GUS表达载体的转基因植株的PCR鉴定图。图中，M为DNA大小指示条带、1-12各泳道均为T0代转基因植株，其中，泳道1、4、7、8、9、10、11、12有条带，为阳性植株。

图2是转基因植株各个组织部位GUS表达活性情况，图中从左至右依次为萌发的种子、分蘖芽基部、茎、叶片、孕穗期的穗、抽穗期的穗、灌浆期的穗。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1OsNPF7.4基因的启动子-GUS转基因植株的构建

提取水稻中花11的DNA，利用扩增引物F(AAGCTTCTAGCATAGTTGCATTTCCCTG，SEQ ID NO.2)和扩增引物R(CCATGGTGCGAGCTGAGCACGAGA，SEQ ID NO.3)通过PCR扩增OsNPF7.4基因的启动子序列后，用HindIII和NcoI酶切连入pCAMBIA-1301载体(pCAMBIA-1301载体购自Cambia公司)，构建出启动子-GUS表达载体pOsNPF7.4-p1301。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，通过转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织将启动子-GUS表达载体导入正常水稻品种中花11中。

将所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，种于大田中，待苗长大后，通过PCR对转基因植株进行检测。检测引物对为：

检测引物F：TCACGGCACTGTGTAGGT(SEQ ID NO.4)，

检测引物R：TACAAAATTATATCAATCCA(SEQ ID NO.5)。

若扩增出624bp的片段，则转基因植株为阳性植株，结果见图1。阳性植株单株收种并种植，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株。

实施例2转基因植株不同部位启动子-GUS表达活性的检测

分别在种子萌发阶段、小苗时期、分蘖期、生殖期对T2代纯合转基因植株的不同部位进行GUS染色，具体过程如下：

收获鉴定成功的T2代种子后，将其浸泡在水中，并在37℃恒温培养箱中培养。待种子萌发阶段，在露白时期以及种子发芽时期分别进行GUS染色。

待种子的芽长到2cm左右，将其播种到96孔板，在温室光照下用全营养液水培，待小苗时期，换用水稻营养液培养，水稻营养液采用国际水稻研究所常规营养液，其成分见下表1。待小苗长到15cm左右，对小苗的叶、根进行GUS染色。

表1国际水稻研究所常规营养液的成分

注：制备微量元素贮备液时，各种盐类分别溶解，再与50mL的硫酸混匀，加蒸馏水稀释至1L。使用时每4L营养液添加微量元素贮备液5mL。用NaOH调节pH值到5.0，每两天换一次培养液。

待小苗长到在20cm左右，将其移栽到土壤里，温室光照培养。待分蘖期，对植株的叶、根、茎和基部进行GUS染色。

在生殖期，分别在孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期和成熟期分别对T2代植株的叶、茎、根和穗等不同组织部位进行GUS染色。

以上材料侵泡于GUS染色液后并置于37℃保温至过夜。然后用75％酒精脱色3次后将其保存于4℃。将用酒精脱色后的材料置于显微镜下观察，蓝色部位为GUS活性表达位点。

结果见图2，经过染色发现GUS活性在分蘖芽基部和穗中较高。

上述结果表明，OsNPF7.4基因的启动子是一个在水稻分蘖芽长出的基部和穗中特异表达的启动子，能够启动下游基因在水稻分蘖芽基部和穗中特异性表达，该启动子的表达部位与水稻产量的重要性状分枝(分蘖和穗分枝)关系密切。将该启动子应用于转基因工程中，可在水稻营养生长阶段促进分蘖芽的伸长或基因在分蘖芽基部的表达积累；同时，也可在水稻生殖生长阶段促进穗灌浆结实或基因在穗部的表达积累。因此OsNPF7.4基因的启动子在转基因工程中有良好的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。