一种食品及饲料中鸭源成分检测用试纸条试剂盒及其应用的制作方法

文档序号:11126268阅读:598来源:国知局
一种食品及饲料中鸭源成分检测用试纸条试剂盒及其应用的制造方法与工艺

本发明涉及食品检测技术领域,具体是一种食品及饲料中鸭源成分检测用试纸条试剂盒及其应用。



背景技术:

欧盟和美国分别在1994年和1997年制定禁止在反刍动物的饲料中添加反刍动物源性蛋白的法规,2000年欧盟将这项禁令扩大到禁止向用于食用的动物饲喂加工过的哺乳动物、鸟类和鱼类蛋白成分。我国农业部于2004年颁布的《动物源性饲料产品安全卫生管理办法》中规定禁止在反刍动物饲料中使用动物源性饲料产品(乳及乳制品除外),但在动物饲料中人为掺入反刍动物(主要是牛、羊)肉和骨制品的现象时有发生。

鸭源性成分(Duck-derivedmaterials)鸭种属DNA片段。市场销售的牛羊肉及肉制品中,很多都掺杂鸭肉,冒充牛羊肉进行销售,为弥补羊肉味不足,有的甚至掺入羊肉粉、羊肉精膏等添加剂来粉饰其掺假行为,市场上出现了名副其实的“挂羊头卖鸭肉”等严重掺假造假行为,拿鸭肉添加羊肉香精,制成羊肉去欺骗消费者,这既违反相关规定,更是一种商业欺诈。

传统的食品及饲料中动物性成分鉴定主要通过显微镜检、基于蛋白质检测的免疫学方法以及基于核酸检测的各类PCR方法,近年还发展了近红外检测法(NIRS)。饲料成分中掺入的各种动物源成分在高温处理和加工过程中易于受到破坏,不同种属动物的蛋白质序列之间差异不大,难以区别,发明专利“SDS-PAGE法鉴别肉及肉制品中动物源性成份”(公开号:CN102213720A)提供了一种以蛋白质的SDS-PAGE电泳方式鉴定猪、牛、羊、鸡、鱼的动物蛋白的方法,但不同来源和处理方式的蛋白电泳谱带不同,带来结果判别的障碍,对于饲料中的动物成分更难以实施。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高特异性的食品及饲料中鸭源成分检测用试纸条试剂盒及其应用。

为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:

一种食品及饲料中鸭源成分检测用试纸条试剂盒,包括核苷酸序列如SEQ ID No.1~2所示的引物组和核酸检测试纸条;所述的引物组的核苷酸序列为上游引物5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’,如SEQ ID No.1所示,下游引物5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’,如SEQ ID No.2所示;所述的核酸检测试纸条的衬底上依次设有样品垫、吸水垫和结合物垫;所述的样品垫由侧向层析基质、嵌于侧向层析基质内的检测带和质控带组成,所述的侧向层析基质为硝酸纤维素膜或尼龙膜,所述的检测带上固定有第二种核酸标记物的抗体,所述的质控带上固定有可结合特定种属来源抗体的抗体;所述的结合物垫上固定有第一种核酸标记物的抗体或配体的胶体金颗粒或乳胶颗粒。

作为本发明进一步的方案:选择生物素分子、异硫氰酸荧光素或地高辛中两种不同的方法对该引物组的5′端分别进行标记,以便于检测。

作为本发明进一步的方案:PCR反应体系包括:10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH2O 1.9μL。

作为本发明进一步的方案:PCR反应条件为:95℃预变性5min,1个循环;94℃变性30sec,60℃退火1min,72℃延伸30sec,扩增30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。

所述的试纸条试剂盒在食品及饲料中鸭源成分检测方法中的应用:取样品进行PCR反应,PCR反应体系包括10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH2O 1.9μL,共20μL;PCR反应条件为:95℃预变性5min,1个循环;94℃变性30sec,60℃退火1min,72℃延伸30sec,扩增30个循环;72℃延伸10min,4℃保存;取5μL PCR扩增产物加入到95μL展开液中进行检测点于样品垫,5min后观察结果:当仅在质控带出现一条红色条带,在检测带内无红色条带出现,证明所测试的样品不含鸭源成分;当出现两条红色条带,一条位于检测带内,另一条位于质控带内,证明所测试的样品含有鸭源成分;当质控带和检测带内均无红色条带出现,表明该核酸试纸条失效。

作为本发明进一步的方案:所述的展开液的组分及含量如下:8mM的Tris、1.2wt.%的BSA、1.4wt.%的吐温20以及0.1~0.2mol/L的NaOH。

与现有技术相比,本发明的有益效果是:

由于本发明是以标记的特异性引物扩增适当长度的基因片段,能够保证检测的高度特异性,从而保证了检测结果的准确性。本发明具有以下优点:操作简单,只需要把核酸扩增后的样品直接滴到试纸条试剂盒的核酸试纸条上即可,不需要专业人员操作,便于推广;快速:检测5分钟后判读结果;灵敏,与琼脂糖凝胶电泳相比,检测灵敏度提高近100~200倍;特异性高,由于在检测过程中加使用的为特异性标记引物,使结果更加准确;价格便宜,费用大大低于传统的凝胶电泳和ELISA检测。

附图说明

图1是特异性试验的检测结果;

图2是灵敏度试验的检测结果;

图中:1-鼠;2-牛;3-兔;4-马;5-羊;6-狗;7-猪;8-猫;9-鸡;10-鸭;11-鹅;12-NTC空白对照(水)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例中,一种食品及饲料中鸭源成分检测用试纸条试剂盒,包括核苷酸序列如SEQ ID No.1~2所示的引物组和核酸检测试纸条;引物组的核苷酸序列为上游引物5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’,如SEQ ID No.1所示,下游引物5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’,如SEQ ID No.2所示;该引物组的5′端分别进行标记以便于检测,具体可以选择生物素分子、异硫氰酸荧光素或地高辛中两种不同的方法标记。核酸检测试纸条的衬底上依次设有样品垫、吸水垫和结合物垫;样品垫由侧向层析基质、嵌于侧向层析基质内的检测带和质控带组成,侧向层析基质为硝酸纤维素膜或尼龙膜,检测带上固定有第二种核酸标记物的抗体,质控带上固定有可结合特定种属来源抗体的抗体;结合物垫上固定有第一种核酸标记物的抗体或配体的胶体金颗粒或乳胶颗粒。

PCR反应体系,包括10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH2O 1.9μL。

PCR反应条件为:95℃预变性5min,1个循环;94℃变性30sec,60℃退火1min,72℃延伸30sec,扩增30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。

将该试剂盒用于食品及饲料中鸭源成分的检测,具体步骤为:

(1)采用两条独特的扩增引物,其中上游引物具有如下序列:5’-TGTTACAGGAAGTTACTCGCCT-3’,如SEQ ID No.1所示,用抗原或半抗原生物素分子、异硫氰酸荧光素或地高辛中的一种标记标记5’端;下游引物的序列为5’-GCGGAAGATACAAAAAGACACT-3’, 如SEQ ID No.2所示,以不同于上游引物的一种标记标记5’端;在适宜的扩增条件下,扩增得到特异性核酸片段扩增产物;当无被检核酸模板存在时,无特异性核酸片段扩增产物;

(2)将一种标准的通用抗体,如抗地高辛抗体与胶体金颗粒交联,在颗粒表面形成包被的抗体;

(3)将另一种标记分子的抗体或配体,如抗异硫氰酸荧光素抗体或生物素分子的配体-链亲和素分子以线条状固定于膜上形成检测线;

(4)当存在待检的特异性扩增产物时,因上游引物、下游引物的作用,扩增产物中同时带有上述三种标记物中的两种,形成标记分子1-扩增产物-标记分子2的复合物;

(5)将步骤(4)形成的标记分子1-扩增产物-标记分子2与胶体金颗粒表面包被的标志物1的抗体结合,形成了抗标志物1抗体-标志物1-扩增产物-标志物2有色颗粒复合物;

(6)将步骤(5)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至涂布有标志物2的抗体或配体的线条上,复合物因与标志物2的抗体(配体)结合而沉积,滞留在检测线上,形成肉眼可见的有色线条,判定为阳性;

(7)当特异性扩增产物不存在时,不发生上述步骤(4)-(6),不能形成标志物1-扩增产物-标志物2复合物,也就不能形沉积于检测线上标志物2的抗体(配体)之上,不形成可见的条带,判为阴性。

实际的检测结果有三种:1)阴性,仅在质控带出现一条红色条带,在检测带内无红色条带出现,证明所测试的样品不含鸭源成分;2)阳性,出现两条红色条带,一条位于检测带内,另一条位于质控带内,证明所测试的样品含有鸭源成分;3)无效,质控带和检测带内均无红色条带出现,表明该核酸试纸条失效。

实施例1

1 材料与方法

鸭基因组DNA

1.2 引物设计

1.3 PCR扩增体系

PCR反应体系,包括10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH2O 1.9μL,共20μL。

PCR反应条件:95℃预变性5min,1个循环;94℃变性30sec,60℃退火1min,72℃延伸30sec,扩增30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。

同时分别取5μL用于核酸试纸条检测,取5μL扩增产物,加入到95μL展开液(8mM的Tris、1.2wt.%的BSA、1.4wt.%的吐温20以及0.1~0.2mol/L的NaOH)中进行检测点于样品垫,5min后观察结果。

1.4 PCR特异性实验

利用建立起来的PCR反应体系对1-鼠;2-牛;3-兔;4-马;5-羊;6-狗;7-猪;8-猫;9-鸡;10-鸭;11-鹅;12-NTC空白对照(水)验证其特异性。

2结果

2.1 PCR反应体系及条件

请参阅图1,采用TAKARA公司的HS Taq DNA polymerase,总反应体系为20μL。用Bio-Rad PCR仪进行检测,反应参数为:95℃预变性5min,1个循环;94℃变性30sec,60℃退火1min,72℃延伸30sec,扩增30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。取5μL产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳,电泳后判断有无特异性条带。核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的检测结果显示于图1中。

2.2 特异性试验

本发明建立的PCR方法对鸭基因组DNA具有较好的特异性,对其他哺乳动物及家禽类物种等无交叉反应。

实施例2

核酸试纸条检测方法的灵敏性,将PCR模板以1/10,1/102,1/103,1/104,1/105,1/106,1/107,1/108,1/109,1/1010的比例稀释后,按已建立的PCR体系进行扩增。

1 材料与方法鸭基因组DNA

1.2 引物设计

1.3 PCR扩增体系

PCR反应体系,包括10×PCR buffer 10μL、上游引物1.8μL、下游引物1.8μL、HS Taq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板4μL、ddH2O 1.9μL,共20μL。

PCR反应条件:95℃预变性5min,1个循环;94℃变性30sec,60℃退火1min,72℃延伸30sec,扩增30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。

分别取5μL用于琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳条件为:1×TBE缓冲液,电压100V,电泳时间30min。同时分别取5μL用于核酸试纸条检测,取5μL样品点于样品垫,加入到95μL展开液(8mM的Tris、1.2wt.%的BSA、1.4wt.%的吐温20以及0.1~0.2mol/L的NaOH)中进行检测,5min后观察结果。

2 结果

2.1 PCR 反应体系及条件

请参阅图2,采用TaKaRa公司的HS Taq DNA polymerase,总反应体系为20μL。用Bio-Rad T-100PCR仪进行检测,反应参数为:95℃预变性5min,1个循环;94℃变性30sec,60℃退火1min,72℃延伸30sec,扩增30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。取5μL产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳,电泳后判断有无特异性条带。核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的敏感度比较结果显示于图2中,由图2的结果可以看出:与传统的凝胶电泳相比,其敏感度增加至少200倍。

对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

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