本发明属于天然产物改性领域，涉及一种抗菌性胶原的制备方法。
背景技术：
胶原是动物皮、骨、结缔组织等的主要组成成分，具有很好的理化性质和生物相容性，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。与胶原蛋白相比，只有保持有三股螺旋结构的胶原分子或其低聚体制成的生物医学材料才具有优良的生物活性，因此在制备生物材料方面主要使用胶原，而非其水解产物胶原蛋白。利用胶原制备细胞培养基质、创伤敷料、人造皮肤等生物医学材料时，其抗菌防腐性能对此类材料的应用范围及应用效果具有非常重要的影响。
但目前的研究主要集中在外加抗菌组分来实现其抗菌作用，对胶原分子进行化学改性，在其分子结构中引入抗菌组分，实现胶原及其材料的抗菌性能的研究较少。
中国专利文件CN 102888027A(申请号：201210364097.5)公开了一种细菌纤维素/胶原-壳聚糖复合材料及其制备方法，包括如下步骤：(1)制备并纯化细菌纤维素；(2)通过负压渗透法或正压法将胶原充分浸入细菌纤维素的网络中，再利用交联剂交联细菌纤维素/胶原复合材料中的胶原，制得细菌纤维素/胶原互穿网络复合材料；(3)将上述复合材料除去未反应的交联剂后，再在壳聚糖或其衍生物类抗菌剂溶液中浸泡，制备得到具有抗菌效果的复合材料。但是，该复合材料仅仅是从提高抗菌材料的力学强度方面对抗菌材料进行处理，没有对胶原分子进行化学改性，从根本上解决胶原的抗菌性能。
中国专利文件CN101163749A(申请号：200680012963.7)公开了一种用于消毒胶原蛋白制剂的方法，自消毒、抗菌胶原蛋白制剂的制备，并且涉及其用于制备特别是用于医药和/或者美容目的胶原蛋白制品(例如海绵、膜或者凝胶)的用途,并且涉及由所述自消毒胶原蛋白制剂制备的制品。该制备自消毒、抗菌胶原蛋白制剂的方法，是向胶原蛋白水溶液或者含水胶原蛋白悬浮液中加入水溶性抗菌活性剂。但上述方法制备的胶原蛋白的抗菌时间短，抗菌组分易流失，且存在抗菌组分被人体吸收的风险。更重要的是，胶原与胶原蛋白在生物活性方面存在巨大差异，后者很难实现前者的生物活性；两者的溶解性也存在巨大差异，胶原虽然具有亲水性但很难溶解于中性水溶液中，用上述方法不能获得抗菌性的胶原。因此在胶原分子结构中以化学键引入牢固的抗菌组分，制备抗菌性胶原，在生物医学材料、化妆品等领域具有更广的应用前景和更好的应用效果。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗菌性胶原的制备方法，该方法可得到抗菌性胶原。
本发明的技术方案如下：
一种抗菌性胶原的制备方法，包括下述步骤：
(1)将胶原溶解于缓冲溶液中，控制胶原的质量浓度为0.1％～15％，得胶原溶液；
(2)向步骤(1)中的胶原溶液中加入改性三氯生，升温至25～50℃，反应0.1～48h，得抗菌性胶原溶液；
(3)将步骤(2)得到的抗菌性胶原溶液在0～4℃透析0.5～96h，然后冷冻干燥，即得抗菌性胶原。
根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的缓冲溶液选自如下体系中的至少一种配置成的缓冲溶液：
巴比妥盐-盐酸体系、硼酸-硼砂体系、甘氨酸-氢氧化钠体系、硼砂-氢氧化钠体系、碳酸钠-碳酸氢钠体系，配制pH＝7～10的缓冲溶液。配制的缓冲溶液的离子强度不做具体要求。
根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的胶原为保持有三股螺旋结构的胶原分子或其低聚体，对其的来源不做具体要求；
进一步优选的，所述的胶原为从动物皮、肌腱等组织中提取的I型胶原。
根据本发明，优选的，步骤(1)中所述的胶原溶液的质量浓度为2.5％～7.5％。
根据本发明，优选的，步骤(2)中改性三氯生的用量为胶原蛋白质量的0.01％～25％，进一步优选0.05％～10％。
根据本发明，优选的，步骤(2)中胶原与改性三氯生的反应温度为30～40℃，反应时间为12～24h。
根据本发明，优选的，步骤(3)中反应结束后将抗菌性胶原溶液透析48～72h，冷冻干燥的时间、温度等参数不做具体要求，按本领域常规操作即可。
根据本发明，优选的，步骤(2)中所述的改性三氯生具有式(I)所示的结构，
式(I)中：R为Cl或
根据本发明优选的，所述步骤(2)中改性三氯生的制备方法如下:
将三氯生溶于四氯化碳溶液中，于4摄氏度用浓硫酸磺化2h～8h，三氯生与浓硫酸的摩尔比为1:1.1～1:1.5，分离纯化后中和，得三氯生磺化物；然后将三氯生磺化物溶于蒸馏水，加入三聚氯氰，三氯生磺化物与三聚氯氰的摩尔比为3:1～1:3，在冰水浴中反应1h～5h，最后用氢氧化钠溶液中和至中性，即得改性三氯生。
根据本发明改性三氯生的制备方法，优选的，三氯生磺化物与三聚氯氰的摩尔比为2:1～1:1。
本发明的有益效果如下：
本发明所制备的抗菌性胶原，抗菌组分以共价键牢固结合于胶原蛋白中，抗菌效果更加持久，如将其制备成抗菌型胶原凝胶、胶原海绵、创伤敷料、组织工程的细胞支架等生物医学材料，则材料在整个使用周期中都具有抗菌作用。本发明所制备的抗菌性胶原的抗菌组分不易流失，不存在抗菌组分被人体吸收的风险。因此，本发明制备的抗菌性胶原具有更好的市场前景。
附图说明
图1为本发明试验例中的抗菌效果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进一步阐述，应该指明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例中所用原料，如无特殊说明，均为常规市购产品。
实施例1
一种抗菌性胶原的制备方法，包括下述步骤：
(1)使用0.04mol/L的巴比妥盐水溶液与0.2mol/L的盐酸水溶液配制pH为8.0的缓冲溶液；
将牛皮中提取I型胶原溶解于缓冲溶液中，控制胶原的质量浓度为5％，得胶原溶液；
(2)将胶原质量1.5％的改性三氯生加入步骤(1)的胶原溶液中，升温至35℃，反应24h，得抗菌性胶原溶液；
(3)将步骤(2)得到的抗菌性胶原溶液在0～4℃透析72h，然后冷冻干燥，即得抗菌性胶原。
本实施例中，所述的改性三氯生具有如下结构：
制备过程如下：
将三氯生溶于四氯化碳溶液中，于4摄氏度用浓硫酸磺化4h，三氯生与浓硫酸的摩尔比为1:1.15，分离纯化后中和；然后将三氯生磺化物溶于蒸馏水，加入三聚氯氰，三氯生磺化物与三聚氯氰的摩尔比为1:1，在冰水浴中反应1h，最后用氢氧化钠溶液中和至中性。
实施例2
一种抗菌性胶原的制备方法，包括下述步骤：
(1)使用0.05mol/L的硼砂水溶液与0.2mol/L的硼酸水溶液配制pH为7.8的缓冲溶液；
将从鼠尾键中提取的I型胶原溶解于缓冲溶液中，控制胶原的质量浓度为2.5％，得胶原溶液；
(2)将胶原质量5％的改性三氯生加入步骤(1)得到的胶原溶液中，升温至30℃，反应36h，得抗菌性胶原溶液；
(3)将步骤(2)得到的抗菌性胶原溶液在0～4℃透析48h，然后冷冻干燥，即得抗菌性胶原。
本实施例中，所述的改性三氯生为具有如下两种结构的混合物：
制备过程如下：
将三氯生溶于四氯化碳溶液中，于4摄氏度用浓硫酸磺化5h，三氯生与浓硫酸的摩尔比为1:1.3，分离纯化后中和；然后将三氯生磺化物溶于蒸馏水，加入三聚氯氰，三氯生磺化物与三聚氯氰的摩尔比为1.5:1，在冰水浴中反应3.5h，最后用氢氧化钠溶液中和至中性。
实施例3
一种抗菌性胶原的制备方法，包括下述步骤：
(1)使用0.2mol/L的甘氨酸水溶液与0.2mol/L的氢氧化钠水溶液配制pH为9.2的缓冲溶液；
将从猪皮中提取的I胶原溶解于缓冲溶液中，控制胶原的质量浓度为2％，得胶原溶液；
(2)将胶原质量20％的改性三氯生加入步骤(1)得到的胶原溶液中，升温至37℃，反应24h，得抗菌性胶原溶液；
(3)将步骤(2)得到的抗菌性胶原溶液在0～4℃透析48h，然后冷冻干燥，即得抗菌性胶原。
本实施例中，所述的改性三氯生具有如下结构：
制备过程如下：
将三氯生溶于四氯化碳溶液中，在冰水浴中用浓硫酸磺化3h，三氯生与浓硫酸的摩尔比为1:1.4，分离纯化后中和；然后将三氯生磺化物溶于蒸馏水，加入三聚氯氰，三氯生磺化物与三聚氯氰的摩尔比为2:1，在冰水浴中反应4.5h，最后用氢氧化钠溶液中和至中性。
实施例4
一种抗菌性胶原的制备方法，包括下述步骤：
(1)使用0.1mol/L的碳酸钠水溶液与0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液配制pH为10.5的缓冲溶液；
将从鲤鱼皮中提取的I型胶原溶解于缓冲溶液中，控制胶原的质量浓度为15％，得胶原溶液；
(2)将胶原质量10％的改性三氯生加入步骤(1)得到的胶原溶液中，升温至37℃，反应48h，得抗菌性胶原溶液；
(3)将步骤(2)得到的抗菌性胶原溶液在0～4℃透析72h，然后冷冻干燥，即得抗菌性胶原。
本实施例中，所述的改性三氯生具有如下结构：
制备过程如下：
将三氯生溶于四氯化碳溶液中，在冰水浴中用浓硫酸磺化3h，三氯生与浓硫酸的摩尔比为1:1.4，分离纯化后中和；然后将三氯生磺化物溶于蒸馏水，加入三聚氯氰，三氯生磺化物与三聚氯氰的摩尔比为2:1，在冰水浴中反应4.5h，最后用氢氧化钠溶液中和至中性。
试验例
用滤纸片法测定了实施例1、2、3对大肠杆菌的抗菌性能。将灭菌用的滤纸片用以上样品溶液浸透，置于已接种了大肠杆菌的培养基上，将培养基置于37.5℃的培养箱中培养12h，其抗菌效果如图1所示，由图1可以看出本发明合成的胶原具有较好的抑制效果，而未改性胶原则不具有抑菌效果。