本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的引物/探针和试剂盒，更具体地，涉及一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的微滴式数字聚合酶链式反应(dropletdigitalpolymerasechainreaction,ddpcr)试剂盒和检测方法。
背景技术：
霍乱弧菌(v.cholera)是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻和失水，死亡率甚高。霍乱弧菌主要存在于近海水域，通常可经污染的水源或食物尤其是水产品而感染人。o1和o139是霍乱弧菌两个最主要的致病血清型，同霍乱的大规模暴发流行密切相关，其主要的毒力因子包括ctxab基因编码的霍乱毒素(ct)和tcpa基因编码的毒力协同调节菌毛(tcp)。霍乱弧菌的其他血清型统称为非o1/非o139，主要引起散发的霍乱样疾病，多分离自轻度腹泻病人和环境样本中。近年来研究显示，由于血清型间存在基因的水平转移，部分o1和o139群霍乱弧菌并不会产生ct和tcp，也不存在相应编码基因，而部分非o1/非o139群霍乱弧菌也可能获得上述致病基因，而成为潜在的新暴发流行株。因此，加强对食品等环境样品中霍乱弧菌及其致病基因的检测鉴定，对于防止疾病的爆发流行，确保食品安全具有重要的现实意义。
目前针对霍乱弧菌的标准检测方法仍以传统增菌培养法为主，需要经过增菌培养、选择性平板分离、生化鉴定、血清学试验等复杂的过程，不仅耗时费力，而且样品中潜在的其他杂菌有可能会因过度增殖而给目标菌鉴定造成干扰。另外，食品中的霍乱弧菌经常以“活的不可培养状态(vbnc)”存在，培养法无法有效检测到这部分细菌，从而影响检测结果的准确性。近年来，以实时荧光pcr(qpcr)为代表的分子生物学方法也逐渐被广泛应用到霍乱弧菌的检测中去，较传统方法更加简便、快速、灵敏、特异，并可实现对靶基因的定量检测。但qpcr属于相对定量，结果的准确性和重复性在很大程度上依赖于所绘制的标准曲线质量及扩增效率，并且需要具备已知浓度的核酸标准品。目前尚没有一个官方权威机构可以提供这种具有明确量值(即核酸拷贝数或质量浓度)的霍乱弧菌核酸标准品。在实际检测中对自行构建的核酸标准分子的定量分析多采用紫外分光光度法，得到的是260nm处所有核酸分子的吸光度值，标准品中其他dna或rna分子以及蛋白等杂质成分均会影响测定结果的准确性。正是由于qpcr定量检测中缺乏统一的核酸标准品，加上样品中存在不同程度的核酸扩增抑制成分干扰导致标准品和待测样品扩增效率的差异，因此，不同实验室间qpcr的定量检测结果往往缺少可比性。
新兴的微滴式数字pcr(ddpcr)被认为是第三代核酸扩增技术，通过把稀释到一定浓度的dna分子分布到10000～20000个微滴中，使大部分微滴中dna分子的数量为1或0，然后通过pcr扩增和阳性信号的累积来读取阳性反应单元数，再根据泊松分布计算出样本中的dna分子数，从而实现对dna分子的绝对定量。目前该技术用于微生物的定量分析尚处于起步阶段，相关的研究如临床样本中人疱疹病毒、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、沙眼衣原体、寄生虫隐孢子虫，牛粪便样本中产志贺毒素的大肠埃希氏菌，以及导致梨火疫病和马铃薯褐腐菌病的植物病原菌等，尚未见到可用于食品中霍乱弧菌定量检测的相关报道。由于食品基质多富含蛋白、脂肪、果胶等核酸扩增抑制成分，背景菌构成复杂且浓度较高，因此，ddpcr对食品中霍乱弧菌定量分析的有效性和实用性尚未可知，开发空间和应用前景广阔。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种特异性强、灵敏度高、扩增效果好的用于检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的ddpcr引物和探针；
本发明的第二个目的在于提供一种操作简单、精确度高的绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的ddpcr试剂盒；
本发明的第三个目的在于提供一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的ddpcr方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明通过选取单拷贝具有种属特异性且高度保守的n-乙酰葡糖胺(glcnac)结合蛋白a的编码基因gbpa(genbankno.eu072441.1)及毒力协同调节菌毛编码基因tcpa(genbankno.kp187623.1)作为靶序列，各设计出3对引物和探针组合，具体序列见表1，经过筛选最终获得特异性强、灵敏度高、扩增效果好的用于检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的ddpcr引物和探针(gbpa-f2/r2/p2和tcpa-f1/r1/p1)，其中，gbpa基因探针5’端标记vic，tcpa基因探针5’端标记fam，两个探针的3’端均标记bhq。
表1ddpcr引物/探针序列
a)引物/探针位置分别参考genbankno.eu072441.1和kp187623.1序列信息。
本发明绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的ddpcr试剂盒，该试剂盒包含上述ddpcr引物和探序列。进一步，试剂盒还包括完成ddpcr反应所需材料和试剂，如阳性对照dna、ddpcrmastermix、微滴生成油、微滴生成卡、twintecsemi-skirted96孔板、铝箔热封膜。
本发明还提供了绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的ddpcr方法，包括：
(1)提取待测样品基因组的dna；
(2)配置ddpcr反应体系：具体见表2，包括序列表中seqidno.1至seqidno.6所示的引物和探针；
表2ddpcr反应体系
(3)微滴生成：将ddpcr反应体系和微滴生成油加入到微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴；
(4)扩增反应：将生成的微滴转移到96孔板中，封膜后置于pcr仪上进行扩增反应，具体条件见表3；
表3ddpcr反应条件
注：升降温速度应≤2.5℃/s
(5)结果判定
将扩增后的96孔板置于微滴读取仪(qx100,bio-rad,pleasanton,ca)中，利用quantasoft软件进行结果读取和分析。含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产物的阴性微滴会呈现出荧光信号强度的差异，以阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界来设定阈值线。按照泊松分布原理计算获得待测样品中扩增靶基因gbpa和tcpa的拷贝数，分别代表总霍乱弧菌和致病性霍乱弧菌的含量。
本发明的有益效果如下：
本发明首次开发出能同时区分致病和非致病性霍乱弧菌的双重ddpcr定量检测方法和试剂盒，其不仅适用于粪便等临床样本，更适于对水产等食品样品的检测，为水产等高风险食品提供了一种新的霍乱弧菌定量检测方法，为保障食品安全、开展风险评估等工作提供了有力的武器。具体而言，该ddpcr定量检测技术较传统培养法和qpcr法具有以下优势：1)ddpcr针对霍乱弧菌单拷贝种属特异性基因gbpa和致病性基因tcpa的双重检测体系，通过单管反应即可鉴定出样品中是否含有产毒或非产毒霍乱弧菌，并对其实现定量检测；2)对gbpa和tcpa基因的最低定量限均可达100拷贝(cfu)/g，满足国内外对食品中霍乱弧菌污染最低控制水平的要求；3)无需进行增菌培养及后续的特征性菌落分离、生化分析、血清学鉴定等步骤，大幅缩短检测时间，简化操作流程；4)直接提取水产等样品匀浆dna，无需对样品进行复杂的稀释和检测重复，减少了稀释偏差对定值结果的影响；5)ddpcr针对细菌基因组的检测，能有效检测到活的不可培养状态(vbnc)的细菌，从而弥补培养法在vbnc细菌检测中的欠缺；6)对靶基因的直接绝对定量，无需依赖任何核酸标准品，不需要绘制标准曲线，避免了由pcr扩增效率差异所导致的偏差；7)由于ddpcr是终点检测，对样品中抑制剂的耐受度更高；8)特别适于低污染水平样品的定量分析，具有更高的精确度和重复性，易于标准化。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出qpcr对引物探针的筛选(a、b)与特异性验证(c、d)；
图2示出ddpcr对引物探针的筛选(a、b)与特异性验证(c、d)；
图3示出梯度稀释的o139群霍乱弧菌纯菌液gbpa基因(a)与tcpa基因(b)的qpcr扩增图谱；
图4示出梯度稀释的o139群霍乱弧菌纯菌液gbpa基因(a)与tcpa基因(b)的ddpcr扩增微滴分布图；
图5示出o139群霍乱弧菌纯菌液中gbpa与tcpa基因浓度定值结果比较。x轴代表ddpcr定值检测时对纯菌液的稀释倍数，虚线代表利用核酸分析仪测得结果的对数平均值(9.45)，点线代表平板计数测得结果的对数平均值(9.04，按照1cfu菌落含1拷贝基因组计算)；
图6示出双重qpcr检测的标准曲线(a、b)与人工污染虾皮样品扩增曲线(c、d)；
图7示出人工污染虾皮样品中gbpa基因(a)和tcpa基因(b)的ddpcr扩增微滴分布图；
图8示出qpcr(a)和ddpcr(b)对人工污染虾皮样品中o139群霍乱弧菌含量测定结果同平板计数预计值间的相关性分析；
图9示出qpcr和ddpcr对人工污染虾皮样品中o139群霍乱弧菌gbpa与tcpa拷贝数比值的测定结果比较。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1试验菌株及培养条件
共使用178株菌(表4)，其中包括1株o1群霍乱弧菌、1株o139群霍乱弧菌、100株非o1/非o139群霍乱弧菌自分离菌株、其他弧菌标准/自分离菌株56株，以及其他常见的食源性致病菌标准菌株20株。所有弧菌和非弧菌菌株分别在t1n1琼脂平板和bhi琼脂平板上活化3代后，挑取单菌落分别接种于5ml碱性蛋白胨水(apw)和5ml脑心浸液肉汤(bhi)液体培养基中，37℃110r/min震荡培养18h。
表4实验用菌株列表
注：atcc：美国典型培养物保藏中心；cmcc：医学微生物菌种保藏管理中心；cgmcc：中国一般微生物典藏中心；bjciq：北京出入境检验检疫局；gdciq：广东出入境检验检疫局。
实施例2ddpcr引物、探针的设计
为实现对总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的特异性检测和绝对定量分析，我们分别选取单拷贝具有种属特异性且高度保守的n-乙酰葡糖胺(glcnac)结合蛋白a的编码基因gbpa(genbankno.eu072441.1)及毒力协同调节菌毛编码基因tcpa(genbankno.kp187623.1)作为靶序列，通过ncbi在线工具进行序列分析和比对，利用primeexpress软件v3.0(abi,fostercity,ca,usa)各设计出3对引物和探针，序列见表1。
实施例3ddpcr检测
1、反应预混液的配制
按照表2配制20μl的ddpcr反应预混液。
2、微滴生成
将20μl的ddpcr反应预混液和70μl微滴生成油分别加入到8孔微滴生成卡中，置于微滴生成仪(qx100,bio-rad,pleasanton,ca)中生成微滴。
3、扩增反应
将生成的油包水的微滴(40μl)缓慢转移至96孔板中，封膜后置于pcr仪(geneamp9700,appliedbiosystems,fostercity,ca)上进行扩增反应，扩增条件如表3所示。
4、结果判定
将扩增后的96孔板置于微滴读取仪(qx100,bio-rad,pleasanton,ca)中，利用quantasoft软件进行结果读取和分析。含有扩增产物的阳性微滴与不含扩增产物的阴性微滴会呈现出荧光信号强度的差异，以阴性微滴簇荧光幅度的最高点为界来设定阈值线。按照泊松分布原理计算获得待测样品中扩增靶基因gbpa和tcpa的拷贝数，分别代表总霍乱弧菌和致病性霍乱弧菌的含量。
实施例4qpcr检测
为便于同ddpcr方法进行比较，选用同一套引物和探针进行qpcr检测。25μl的双重qpcr反应体系包括：2×mastermix12.5μl，10μm的gbpa-f、gbpa-r、tcpa-f和tcpa-r各1μl，10μm的gbpa-p和tcpa-p各0.5μl，待测dna模板2μl。于abi7900荧光pcr仪(美国，abi公司)或lightcycler480ii(瑞士，罗氏公司)上进行扩增，50℃2min，95℃10min，进而95℃15s、60℃1min，45个循环。反应完成后利用sds3.2或sw1.5.1软件进行分析，根据标准曲线计算靶基因的拷贝数。
实施例5ddpcr引物、探针的筛选
首先，采用qpcr方法对已设计合成的gbpa与tcpa基因引物探针进行筛选。通过对o139群霍乱弧菌基因组dna的检测，发现所有引物探针均能有效扩增出靶基因，但引物探针组gbpa-f2/r2/p2和tcpa-f1/r1/p1的荧光信号出现时间最早，扩增效果最好(图1a、b)。为保证扩增反应的特异性，本实验选取gbpa-f2/r2/p2和tcpa-f1/r1/p1两组引物探针，对表4中所列常见弧菌和食源性致病菌dna进行检测，结果发现o1群霍乱弧菌、o139群霍乱弧菌和非o1/非o139群霍乱弧菌均出现gbpa基因阳性扩增信号，而只有o1群霍乱弧菌和o139群霍乱弧菌出现tcpa基因阳性扩增信号，非o1/非o139群霍乱弧菌呈tcpa基因阴性，此外，其他常见弧菌及食源性致病菌gbpa和tcpa的检测均呈阴性(图1c、d)。表明这两组引物、探针均具有良好的特异性。
继而采用ddpcr对o139群霍乱弧菌基因组dna进行检测，进一步验证上述引物、探针的有效性。结果发现所有引物、探针扩增后均能出现明显的阳性微滴簇和阴性微滴簇，且引物探针组gbpa-f2/r2/p2和tcpa-f1/r1/p1的荧光信号强，阴性和阳性微滴簇更加集中(图2a、b)，扩增效果最好。进一步利用常见弧菌对ddpcr检测体系中引物探针的特异性进行验证，发现同qpcr检测结果一样，o1群、o139群和非o1/非o139群霍乱弧菌均出现gbpa基因阳性微滴簇，副溶血性弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌与河流弧菌gbpa基因ddpcr检测均呈阴性(图2c)；此外，只有o1群和o139群霍乱弧菌出现tcpa基因阳性微滴簇，非o1/非o139群霍乱弧菌和其他5株弧菌均无tcpa基因阳性微滴出现(图2d)。综上可见，gbpa-f2/r2/p2和tcpa-f1/r1/p1灵敏、特异，且同时满足qpcr和ddpcr的扩增条件，将其用于后续的定量分析试验和试剂盒的组装。gbpa基因探针5’端标记vic，tcpa基因探针5’端标记fam，两个探针的3’端均标记bhq，从而可在同一ddpcr反应体系中完成对两种基因的同步扩增检测，实现对总霍乱弧菌和致病性霍乱弧菌的分别鉴定。
实施例6检测总霍乱弧菌和致病性霍乱弧菌的ddpcr试剂盒
试剂盒主要包括：
(1)用于检测总霍乱弧菌的引物和探针(gbpa-2f、gbpa-2r、gbpa-2p)；
(2)用于检测致病性霍乱弧菌的引物和探针(tcpa-1f、tcpa-1r、tcpa-1p)；
(3)阳性对照：o139群霍乱弧菌基因组dna，1000拷贝/μl；
(4)ddpcrmastermix：购自美国biorad公司；
(5)微滴生成油：购自美国biorad公司；
(6)微滴生成卡：购自美国biorad公司；
(7)twintecsemi-skirted96孔板：购自德国eppendorf公司；
(8)铝箔热封膜：购自美国biorad公司。
实施例7霍乱弧菌纯菌液的检测
1、基因组dna提取与核酸蛋白分析仪测定
利用氯化钠碱性蛋白胨水对o139群霍乱弧菌参照菌株的过夜培养物进行10倍梯度稀释。采用细菌基因组dna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：dp302)提取各稀释度菌液dna，提取步骤按照试剂盒说明书进行，最终将核酸溶解在50μlte缓冲液中。对提取的核酸用核酸蛋白分析仪(beckmancoulter,du800)进行浓度和纯度的测定，确保提取核酸的a260/a280在1.8-2.0之间，并按下列公式计算提取霍乱弧菌基因组dna的拷贝浓度：
其中m代表核酸蛋白分析仪测得的核酸浓度(ng/μl)；n代表细菌基因组的长度(bp)，根据ncbi上已经发布的霍乱弧菌基因组的测序数据，其平均长度为4.01×106bp。
o139群霍乱弧菌参照菌株在氯化钠碱性蛋白胨水中的过夜培养物1ml，提取的基因组dna(共50μl)浓度为250ng/μl，代入上述公式算得提取到的基因组dna浓度为5.7×107拷贝/μl，按照1拷贝基因组对应1个cfu菌落，则原始菌液浓度为2.85×109cfu/ml，其对数值为9.45。
2、平板计数
同时对10倍梯度稀释的o139群霍乱弧菌参照菌株纯菌液，分别吸取1ml菌悬液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。及时将15～20ml冷却至46℃的平板计数t1n1琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，36℃倒置培养24h±2h。选取菌落数在30～300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，每个稀释度菌落数应取两个平板的平均数。结果测得原始菌液浓度为1.1×109cfu/ml，其对数值为9.04。
3、qpcr和ddpcr检测
各稀释度菌液提取到的dna同时进行双重qpcr和双重ddpcr检测，结果发现两者对gbpa与tcpa两个基因均可检测到10-7稀释度(图3，图4)，具有相同的检测灵敏度。双重ddpcr在10-2稀释度达到检测上限，阳性微滴的比率达100％，自10-3至10-7稀释度菌液测得的gbpa与tcpa基因浓度均呈现出良好的线性关系(图4，表5)。在定值范围内ddpcr测定结果具有高度一致性，由不同稀释度菌液计算出原菌液中霍乱弧菌gbpa与tcpa基因含量的对数平均值值分别为9.22与9.25，同核酸蛋白分析仪和平板计数法测得值仅相差0.18～0.23个log值(图5)。
表5梯度稀释的o139群霍乱弧菌纯菌液ddpcr定量检测结果
实施例8人工污染虾皮样品的检测
选择经传统方法验证无霍乱弧菌的虾皮样品作为添加基质。对o139群霍乱弧菌参照菌株的过夜培养菌悬液进行10倍梯度稀释并平板计数，同时取10-4、10-5、10-6、10-7稀释度菌液各25ml分别添加到盛有25g虾皮样品的均质袋中，各添加浓度分别设5个样品重复，另取1份25g虾皮样品加入apw代替添加菌液作为阴性对照，上述样品用拍击式均质器拍击2min，制成系列1:1含有不同浓度o139群霍乱弧菌的污染样品。取各样品匀液2ml分别利用试剂盒(天根生化科技有限公司，货号：dp302)法提取细菌基因组dna，最终将核酸溶解在50μlte缓冲液中，进行双重ddpcr和双重qpcr检测，比较两者的定值效果。
在进行双重qpcr时，以10倍梯度稀释的o139群霍乱弧菌基因组dna(经核酸蛋白分析仪测定其原液浓度为4.66×107拷贝/μl)作为标准品，同人工污染样品中提取的dna一起进行扩增检测。以标准品检测ct值作为纵坐标，其对应核酸浓度的对数值为横坐标，分别绘制得到gbpa基因和tcpa基因的标准曲线(图6a、b)。同时qpcr检测结果显示4个不同污染水平的虾皮样品均呈阳性扩增，其扩增曲线如图6c、d所示，根据检测ct值和得到的标准曲线计算污染样品中gbpa基因平均含量分别是368500、32500、5500、300拷贝/g(表6)；tcpa基因的平均含量则分别是238500、14050、3100、250拷贝/g(表6)。
而双重ddpcr检测结果显示，随着污染水平的下降，gbpa基因和tcpa基因出现的阳性微滴数量均逐渐减少(图7)，根据阳性微滴数量和泊松分布原理，由quantasoft软件计算直接测定的gbpa基因含量分别为99250、9530、830、98拷贝/g(表6)；tcpa基因的平均含量则分别是105600、9800、1020、118拷贝/g(表6)。
根据添加菌液的平板计数结果，预计10-7至10-4菌液污染样品中o139群霍乱弧菌含量为110～110000cfu/g。因此，按照1个拷贝靶基因对应1个cfu菌来计算，无论是gbpa还是tcpa基因，ddpcr的定值结果更接近平板计数预计值，线性分析发现ddpcr定值结果与平板计数结果存在0.90～0.96倍的关系(图8b)；而qpcr的定值结果却明显偏高，约为平板计数预计值的2.16～3.35倍(图8a)。其次，ddpcr针对不同污染水平虾皮样品中gbpa与tcpa两个基因测定结果的拷贝数比值在1.03～1.20范围内(图9)，比较接近理论比值1；而qpcr测得的gbpa与tcpa基因含量相差较大，其拷贝数比值在1.20～2.31范围内(图9)，这与两个基因的qpcr扩增效率存在的差异密切相关(根据qpcr检测标准曲线的斜率计算得到gbpa与tcpa基因扩增效率分别是87.3％与95.3％)。而ddpcr是终点检测，定值结果不会受到扩增效率差异的影响，因此根据不同基因测得的目标菌含量具有更好的一致性，定值结果更加准确。此外，对于低污染水平样品(10-7菌液添加)，qpcr的检测ct值多在37～39之间，有1份平行样品的gbpa基因检测甚至为阴性，而ddpcr对于低污染水平样品的测定结果更加准确，在不经增菌培养的条件下，其对gbpa与tcpa两个基因的最低定量限可分别达98拷贝/g和118拷贝/g(表6)，满足国内外对食品中致病性弧菌污染最低控制水平的要求。
表6ddpcr与qpcr对人工污染虾皮样品中o139群霍乱弧菌的定量检测结果
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110>北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>一种绝对定量检测总霍乱弧菌与致病性霍乱弧菌的试剂盒及检测方法
<130>jlc16i0608e
<160>18
<170>patentinversion3.3
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