空间植物乳杆菌LCT‑LP1的培养方法和应用与流程

本发明涉及微生物及生物技术领域，具体涉及一种空间植物乳杆菌LCT-LP1的培养方法和应用。

背景技术：

随着人类空间探索活动的日益频繁，宇宙空间成为了人类活动的一个重要领域。太空密闭舱中存在着特定的微生物群落。虽然每一件物品都经过了严格消毒，微生物仍会随航天员身体、人体分泌物、航空部件等进入太空，并在航天器密闭舱室内形成特定微生物群落，既包括无害微生物，也包括一些致病性和腐蚀性微生物。“和平”号运行十余年来空间站内检测到234种微生物。太空密闭舱内的特殊环境因素，包括微重力、弱磁场和粒子辐射等，使得微生物会产生变异，导致它们对生存环境的要求很低，更加容易生长和繁殖，某些微生物的腐蚀性会增强。太空密闭舱中腐蚀性微生物的大量繁殖，使得各种航天材料逐渐产生腐蚀，加速航天器件的降解耗损，将可能导致空间站内的设备运行失灵，影响航天器的长期正常运行及其在轨使用寿命，甚至对飞行安全也会造成很大威胁。航天器服役条件恶劣，在轨时间长，而维修条件相对不足，一旦发生微生物腐蚀设备故障，损失不可估量。国外载人航天器在轨经验和国内地面研究的初步结果表明，微生物会严重威胁航天设备安全。开展长期太空密闭舱中微生物对航天器材腐蚀的机理及防控措施研究，深化对载人航天器中微生物风险的认识和加强相关技术储备，探索更加有效的载人航天器微生物综合控制措施，为载人航天器的研制和运营提供技术支撑。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种空间植物乳杆菌LCT-LP1的培养方法和应用。

本发明提供了一种培养植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LCT-LP1的方法，包括如下步骤：采用植物乳杆菌培养基培养所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LCT-LP1。

本发明还保护一种制备植物乳杆菌LCT-LP1培养物的方法，包括如下步骤：采用植物乳杆菌培养基培养植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LCT-LP1。

以上任一所述植物乳杆菌培养基中溶质及其在所述植物乳杆菌培养基中的浓度如下：蛋白胨0.5-1.5g/100ml、牛肉膏0.5-1.5g/100ml、酵母膏0.4-0.6g/100ml、KH₂PO₄0.1-0.3g/100ml、柠檬酸三钠0.1-0.3g/100ml、乙酸钠0.1-0.3g/100ml、葡萄糖1-3g/100ml、Tween80 0.05-0.15mL/100ml、MgSO₄·7H₂O 0.048-0.068g/100ml、MnSO₄·4H₂O0.015-0.035g/100ml。

所述溶质及其在所述植物乳杆菌培养基中的浓度具体可为蛋白胨1g/100ml、牛肉膏1g/100ml、酵母膏0.5g/100ml、KH₂PO₄0.2g/100ml、柠檬酸三钠0.2g/100ml、乙酸钠0.2g/100ml、葡萄糖2g/100ml、Tween 800.1mL/100ml、MgSO₄·7H₂O0.058g/100ml、MnSO₄·4H₂O0.025g/100ml。

以上任一所述植物乳杆菌培养基的溶剂为水。

以上任一所述植物乳杆菌培养基的pH为6.2-6.4。

所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LCT-LP1，已于2016年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.12578。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LCT-LP1 CGMCC NO.12578简称为植物乳杆菌LCT-LP1。

本发明还保护植物乳杆菌LCT-LP1在研究微生物对航天器材腐蚀机理中的应用。

本发明还保护植物乳杆菌LCT-LP1在防控微生物腐蚀航天器材研究中的应用。

本发明还保护植物乳杆菌LCT-LP1在研发新型航天抗腐蚀材料中的应用。

本发明还保护植物乳杆菌LCT-LP1在制备微生物对航天器材腐蚀的模型中的应用。

本发明还保护植物乳杆菌LCT-LP1在制备腐蚀航天器材的产品中的应用。

本发明提供了一种对常用航天高分子材料具有腐蚀性的空间植物乳杆菌LCT-LP1的培养方法和应用。实验结果表明，植物乳杆菌LCT-LP1空间飞行组、模拟微重力组和地面1g重力对照组菌株均能腐蚀钛合金与不锈钢，但在空间飞行条件下和模拟微重力条件下更容易在金属材料表面形成生物膜，对钛合金与不锈钢的腐蚀能力较地面1g重力对照组增强。本发明有助于长期太空密闭舱中微生物对航天器材腐蚀的机理及防控措施研究，有助于深化对载人航天器中微生物风险的认识和加强相关技术储备，有助于探索更加有效的载人航天器微生物综合控制措施，为载人航天器的研制和运营提供技术支撑。

附图说明

图1为植物乳杆菌LCT-LP1的扫描电镜形态图。

图2为植物乳杆菌LCT-LP1的菌苔形态图。

图3为植物乳杆菌LCT-LP1的单菌落形态图。

图4为植物乳杆菌LCT-LP1全基因序列谱图。

图5为植物乳杆菌LCT-LP1的COG功能分析。

图6为植物乳杆菌LCT-LP1的GO基因功能注释。

图7为植物乳杆菌LCT-LP1的KEGG代谢途径分析。

图8为植物乳杆菌LCT-LP1的生物膜形成分析。

图9为植物乳杆菌LCT-LP1在TC4钛合金表面的生物膜形成分析。

图10为植物乳杆菌LCT-LP1在304不锈钢表面的生物膜形成分析。

图11为植物乳杆菌LCT-LP1对TC4钛合金腐蚀能力的SEM分析。

图12为植物乳杆菌LCT-LP1对304不锈钢腐蚀能力的SEM分析。

图13为植物乳杆菌LCT-LP1对金属腐蚀能力的AFM分析。

图14为植物乳杆菌LCT-LP1对304不锈钢腐蚀能力的EDS分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下实施例中将植物乳杆菌置于不同实验环境进行实验，根据实验环境不同分为空间飞行组、地面1g重力对照组和模拟微重力组；

空间飞行组的实验环境为：空间飞行条件，即神舟飞船空间搭载环境；

地面1g重力对照组的实验环境为：地面1g重力条件，即地面静置环境；

模拟微重力组的实验环境为：在地面模拟微重力条件下，即用回转器30转/min模拟微重力环境。

植物乳杆菌培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、KH₂PO₄2g、柠檬酸三钠2g、乙酸钠2g、葡萄糖20g、Tween 801mL、MgSO₄·7H₂O0.58g、MnSO₄·4H₂O0.25g，蒸馏水定容至1L，pH 6.2-6.4，121℃灭菌15min。

实施例1、植物乳杆菌LCT-LP1的获得

一、菌种采集

对“神舟十号”飞船返回舱内部进行了微生物的采集，选用细菌培养基对样品进行初筛，然后挑取菌落形态不同的单菌落进行划线培养，纯化到单一菌株后，命名为菌株LCT-LP1。

二、形态学鉴定

将步骤一得到的菌株LCT-LP1进行革兰氏染色，结果显示菌株LCT-LP1为革兰氏阳性，短杆菌。将菌株LCT-LP1的单菌落接种至平板上观察菌落的生长形态，并用扫描电镜观察其显微形态。扫描电镜观察菌体呈短杆状或圆球状排列(见图1)。在软琼脂上的菌落细密，色白(见图2)，有时菌落形态较大，有凸起(见图3)。

三、16S rDNA鉴定

检测步骤一菌株LCT-LP1的16S rDNA，测序结果如序列表的序列1所示。16s rDNA鉴定结果显示菌株LCT-LP1与植物乳杆菌Lactobacillus plantarum subsp.plantarum ATCC 14917(T)的相似性为99.74％。

经过形态学及16S rDNA鉴定，可以确定菌株LCT-LP1属于植物乳杆菌，因此重新将其命名为植物乳杆菌LCT-LP1。

四、植物乳杆菌LCT-LP1的保藏

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LCT-LP1于2016年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12578。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LCT-LP1 CGMCC NO.12578简称为植物乳杆菌LCT-LP1。

五、植物乳杆菌LCT-LP1的全基因组分析

采用高通量Solexa测序技术对植物乳杆菌LCT-LP1进行Paired-End测序。

采用超声法Covaris将大片段基因组DNA随机打断并产生一系列DNA片段；然后用T4DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3′端加碱基“A”，使得DNA片段能与3′端带有“T”碱基的特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的片段连接产物，再使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段；建立300bp的小片段文库。对测序得到的原始数据进行过滤及统计；运用SOAP denovo V1.05软件和SOAPaligner/soap2软件对处理后的reads数据进行组装。并对基因组和基因区覆盖度进行评价；采用Glimmer3.0软件从组装结果中获得基因序列并将基因的序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。

通过对植物乳杆菌LCT-LP1的全基因组分析，其全基因组序列总长度为3,293，854bp，GC含量44.53％，包括3133个编码序列和92个RNA基因(全基因序列图谱如图4所示)，COG数据库比对共注释到20组COG功能分类(图5)，同时对其进行了详细的GO基因功能注释(图6)和KEGG代谢途径分析(图7)。

实施例2、植物乳杆菌LCT-LP1的生物被膜形成实验

1、在无菌条件下，向每个100mL蓝盖瓶中各加入50mL灭菌的植物乳杆菌培养基，然后接入植物乳杆菌LCT-LP1(植物乳杆菌LCT-LP1在培养体系中的初始浓度为10⁴个/m1)，37℃培养2天。

2、将步骤1得到的植物乳杆菌LCT-LP1培养物转接到96孔板中进行恒温37℃培养24h，观察其在孔板中生物被膜形成情况，然后挑选孔板中的菌落转接到玻璃试管中进行培养与对比，再次观察与对比其生物被膜的稳定形成情况。

设置三组处理：第一组处理中，步骤1和步骤2的培养条件均为空间飞行组的培养条件；第二组中，步骤1和步骤2的培养条件均为地面1g重力对照组的培养条件；第三组中，步骤1和步骤2的培养条件均为模拟微重力组的培养条件。

结果如图8所示。图8中，M18-981和M18-1016为模拟微重力组菌落，T18-685为空间飞行组菌落，D18-390、D18-391和D18-392为地面1g重力对照组菌落，图中三个箭头为空间飞行组的3个形成生物膜的菌落。结果表明，空间飞行条件下，孔板中形成生物被膜的菌落最多，其次是模拟微重力条件下的菌落。形成生物被膜的菌落，通过转接试管放大传代培养，发现依然可以形成稳定的生物被膜。结果表明，植物乳杆菌LCT-LP1在空间飞行条件下更容易产生生物膜，其次是模拟微重力条件下，这表明植物乳杆菌LCT-LP1在太空密封舱或模拟微重力条件下生物膜形成机率增加。

实施例3、植物乳杆菌LCT-LP1的腐蚀性实验

一、制备金属测试试片

1、选取金属材料TC4钛合金(Ti-6A1-4V，(α+β)合金)和304不锈钢(OCr18Ni9)，加工成横截面直径为10mm、长为4mm的圆柱形试样，依次用粒度为400#、800#、1200#、2000#金相砂纸打磨。

2、将步骤1打磨后的304不锈钢试样用金刚石研磨膏抛光处理。

3、将步骤1打磨后的TC4钛合金试样用氧化铁和氧化铬溶液来抛光，丙酮除去试样表面油脂，然后在50-60℃下用10％(质量分数)氢氧化钠水溶液侵蚀1-2min，以除去表面氧化层。

4、经过步骤2和步骤3的处理后，将304不锈钢试样和TC4钛合金试样用自来水冲洗后，再浸入30％(体积分数)硝酸水溶液中净化2-6min，最后浸于70-90℃蒸馏水中清洗，吹干后加入到75％(体积分数)乙醇水溶液中15min灭菌，放入无菌一次性培养皿中，标好号，在无菌操作台中风干，备用。

二、腐蚀实验

待测菌株为：植物乳杆菌LCT-LP1、植物乳杆菌14917(ATCC编号：14917)。

1、使用植物乳杆菌培养基37℃培养待测菌株，得到浓度为10⁸CFU/mL的菌悬液。

2、分别将步骤一制备的TC4钛合金金属试样和304不锈钢金属试样加入到50mL的厌氧瓶，厌氧瓶中加入20mL植物乳杆菌培养基，先用高纯氮气吹脱培养基内的空气，然后加入1mL步骤1的菌悬液，在37℃恒温培养箱培养。在培养过程中，进行连续式实验，分别在实验进行到第7、14、21天的时候，对试样进行分析，评定金属材料的腐蚀行为。

设置三组处理，第一组处理中，步骤1和步骤2的培养条件均为空间飞行组的培养条件；第二组中，步骤1和步骤2的培养条件均为地面1g重力对照组的培养条件；第三组中，步骤1和步骤2的培养条件均为模拟微重力组的培养条件。

(1)表面生物膜与腐蚀形态SEM分析。

实验进行到第14天时，将试样置于培养皿，沿壁缓加2.5％戊二醛固定液，将样品淹没至少5mm，固定4h。从固定液中取出样品，蒸馏水清洗样品膜3次，每次15min。依次用体积分数为30％、50％、70％、85％和95％的乙醇水溶液脱水，每级15-20min，用无水乙醇脱水2次，每次15-20min。将试样放入新的培养皿中，倒入六甲基二硅胺烷(将样品淹没至少5mm)放置3min，通风处干燥。干燥后对样品朝上面进行喷金处理，然后利用SEM观察。

结果如图9和图10所示。图9为植物乳杆菌LCT-LP1处理的TC4钛合金金属试样的分析结果图。图10为植物乳杆菌LCT-LP1处理的304不锈钢金属试样的分析结果图。在两种金属材料试验中，植物乳杆菌LCT-LP1地面1g重力对照组样品没有观察到明显的生物膜形成，而植物乳杆菌LCT-LP1空间飞行组样品形成了肉眼可见的生物膜，植物乳杆菌LCT-LP1模拟微重力组也可观察到肉眼可见的生物膜。结果表明，空间飞行条件下和模拟微重力条件下植物乳杆菌在钛合金和不锈钢表面形成生物膜的能力比地面1g重力对照组更强。对照菌株植物乳杆菌14917空间飞行条件下和模拟微重力条件下在钛合金和不锈钢表面形成生物膜的能力与地面1g重力对照组相比无显著差异，均无法观察到明显的生物膜形成。

(2)实验进行到第7、14、21天的时候，运用QUANTA FEG250 FEI扫描电子显微镜观察样本腐蚀产物形貌。

结果如图11和图12所示。图11为植物乳杆菌LCT-LP1处理的TC4钛合金金属试样的观察结果图。图12为植物乳杆菌LCT-LP1处理的304不锈钢金属试样的观察结果图。在两种金属材料试验中，植物乳杆菌LCT-LP1空间飞行组样品金属表面较植物乳杆菌LCT-LP1地面1g重力对照组样品聚集的植物乳杆菌更多，表面腐蚀区域也更多，植物乳杆菌LCT-LP1模拟微重力组样品金属表面聚集的植物乳杆菌数目及表面腐蚀区域面积与空间飞行组情况无显著差异，均大于植物乳杆菌LCT-LP1地面1g重力对照组样品。对照菌株植物乳杆菌14917空间飞行条件下和模拟微重力条件下样品金属表面聚集的植物乳杆菌数目及表面腐蚀区域面积与地面1g重力对照组无显著差异。

(3)实验进行到第7、14、21天的时候，运用Dimension Icon Veeco原子力显微镜对样本进行观察，采用标准硅探针，以0.06N/m的力常数进行接触式扫描。结果如图13所示，图13A为植物乳杆菌LCT-LP1处理的TC4钛合金金属试样的观察结果图。图13B为植物乳杆菌LCT-LP1处理的304不锈钢金属试样的观察结果图。图中Ra为轮廓算术平均偏差，反映金属试样表明粗糙度，图中坐标的单位为nm。结果表明，各组处理中，植物乳杆菌LCT-LP1对304不锈钢金属试样或TC4钛合金金属试样均具有腐蚀性，且随着时间的延长腐蚀程度加重。

第14天，不锈钢表面粗糙度的增加程度低于钛合金。

植物乳杆菌LCT-LP1空间飞行组：与第0天相比，第14天的钛合金表面粗糙度Ra值增加至2.5倍。

植物乳杆菌LCT-LP1模拟微重力组：与第0天相比，第14天的钛合金表面粗糙度Ra值增加至2.5倍。

植物乳杆菌LCT-LP1地面1g重力对照组：与第0天相比，第14天的钛合金表面粗糙度Ra值增加至2.3倍。

植物乳杆菌14917空间飞行组：与第0天相比，第14天的钛合金表面粗糙度Ra值增加至2.0倍。

植物乳杆菌14917模拟微重力组：与第0天相比，第14天的钛合金表面粗糙度Ra值增加至1.9倍。

植物乳杆菌14917地面1g重力对照组：与第0天相比，第14天的钛合金表面粗糙度Ra值增加至1.9倍。

第21天，不锈钢表面粗糙度急剧增加，受到更严重的生物腐蚀。

模拟微重力组植物乳杆菌LCT-LP1对钛合金和不锈钢的腐蚀能力与空间飞行组无显著性差异，第14天时钛合金Ra为10.8nm，第21天时不锈钢Ra为12.5nm，均大于地面1g重力对照组。对照菌株植物乳杆菌14917在空间飞行条件和模拟微重力条件下对钛合金和不锈钢的腐蚀能力与地面1g重力对照组无显著差异。结果表明，空间飞行组和模拟微重力组培养条件下植物乳杆菌LCT-LP1对钛合金和不锈钢的腐蚀能力均大于地面1g重力对照组。

(4)实验进行到第7、14、21天的时候，运用能谱分析(EDS)系统分析腐蚀样品中的元素成分。结果如图14所示，图14为植物乳杆菌LCT-LP1处理的腐蚀样品中元素成分分析结果。EDS分析表明：空间飞行组样品在14天时，其表面碳元素含量的明显提高，氧元素量增加到2.1％，比地面1g重力对照组增加显著，21天的结果也进一步检测到碳元素和氧元素增加显著。这表明空间飞行条件下植物乳杆菌LCT-LP1的生命活动更为强烈，说明金属材料表面生物腐蚀更加严重。

综合以上结果表明，植物乳杆菌LCT-LP1在空间飞行组、模拟微重力组和地面1g重力对照组条件下均能腐蚀钛合金与不锈钢，但在空间飞行条件下和模拟微重力条件下更容易在金属材料表面形成生物膜，对钛合金与不锈钢的腐蚀能力较地面1g重力对照组增强。

<110> 富乐顿生物工程科技（北京）有限公司

<120> 空间植物乳杆菌LCT-LP1的培养方法和应用

<130> GNCYXMN161621

<160> 1

<210> 1

<211> 1530

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）

<400> 1

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