一种高通量筛选乳酸菌素的方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及微生物技术领域，尤其涉及一种高通量筛选乳酸菌素的方法。

背景技术：

乳酸菌素是由益生乳酸细菌在代谢过程中所产生的一类具有较强生物活性的多肽或蛋白质。乳酸菌素由于对病原菌具有高效的抑菌活性且对人畜安全无毒，已在养殖业、食品防腐等众多领域中得到广泛应用。

在养殖领域中，目前普遍存在滥用抗生素、消毒剂的现象，不仅导致病原菌耐药性增加，而且易造成环境污染，影响人体健康。随着病原微生物耐药性的不断增强，传统抗生素使用的弊端日渐显露，抗生素残留带来的安全隐患引起了人们的高度重视。而以乳酸菌素为代表的抗菌肽因其独特的结构和抗菌机制，不易使细菌产生耐药性；且在动物体内可避免药物残留，无免疫原性和细胞毒性，不损伤正常机体细胞。相对于其他蛋白质类的生物制剂，乳酸菌素对温度、酸碱、金属离子、蛋白酶的耐受性强。乳酸菌素产品有望单独使用或与乳酸菌活菌进行复配，用于饲料拌喂，维持畜禽动物肠道的正常微生态平衡，提高其免疫力，促进生长，因而越来越成为饲料行业的热门添加剂。

在食品保鲜领域中，乳酸菌素亦具备巨大的市场开发潜力。例如，乳链菌肽(Nisin)是一种经联合国粮食及农业组织和世界卫生组织确认为安全、高效、可靠的食品防腐剂，并在全世界得到广泛使用。Nisin天然产自食品级的乳酸乳球菌，对革兰氏阳性菌呈广谱抗菌作用，如芽孢杆菌、肉毒杆菌、葡萄球菌、李斯特菌、耐热腐败菌、棒杆菌、小球菌、明串球菌、分枝杆菌等；食用后在消化道中很快被蛋白水解酶消化成氨基酸，故不会在体内残留，也不会改变肠道正常菌群。与其它抗菌肽相比，乳酸菌素的优点是能够在杀灭病原菌的同时，不杀灭乳酸菌自身，因此有利于维持畜禽肠道正常的微生态平衡。

由于乳酸菌素具有广阔的应用市场和开发潜力，近年来针对其进行分离筛选的工作也越来越多。乳酸菌素天然存在于多种乳酸菌中，因而可从中筛选分离得到。现有技术中传统的筛选方法只针对单一或少数几株乳酸菌进行逐一筛选，通过平板/牛津杯法进行抗菌活性筛选。该方法的特点是批量较小，针对性强，但难以同时对上百株菌进行筛选，效率低下。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高通量筛选乳酸菌素的方法，所述方法可快速筛选出针对特定目标指示菌具有显著抑菌活性的乳酸菌素等抗菌物质，极大地提高了筛选效率。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种高通量筛选乳酸菌素(又称乳酸菌肽、乳酸菌抗菌肽)的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)培养病原菌；

(2)培养乳酸菌；

(3)在多孔板上加入LB培养基、步骤(1)培养的病原菌发酵液和步骤(2)培养的乳酸菌发酵液上清，在多孔板上共培养8-25h，用酶标仪定时测量OD600的吸光度；

其中，所述多孔板为24孔板、48孔板、96孔板或384孔板中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，所述乳酸菌产生的乳酸菌素会分泌到细胞外，通过离心将乳酸菌发酵液的上清用于检测，既可以只测试上清中的乳酸菌素的效果，又可以排除乳酸菌菌体本身对检测的影响。

本发明，步骤(3)检测时，由于用多孔板进行，便于做平行试验，一般会做3个平行试验，同时也会做多个对照组，采用的对照组为以200μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液+198μL灭菌LB培养基、20μL乳酸菌发酵液上清+180μL灭菌LB培养基为对照。

作为优选技术方案，所述乳酸菌发酵液的上清通过将乳酸菌发酵液进行离心获得，所述离心转速为8000-12000g，例如可以是8000g、8100g、8200g、8300g、8500g、8600g、8800g、10000g、10100g、10500g、10600g、10800g、11000g、11300g、11500g、11800g或12000g，优选为10000g；所述离心时间为1-15min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min，优选为3-10min，进一步优选为5min。

本发明中，所述培养时间例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、15h、16h、18h、20h、21h、23h或25h。

优选地，步骤(1)所述的病原菌为虾致病菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述乳酸菌为从动物消化道及生殖道中分离所得乳酸细菌。

优选地，所述乳酸菌选自但不限于：格氏乳杆菌、发酵乳杆菌、卷曲乳酸杆菌、淀粉乳杆菌、乳酸肠球菌、海氏肠球菌、粪肠球菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、台湾乳球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌属、乳酸片球菌、戊糖片球菌、非解乳糖链球菌、海豚链球菌、巴黎链球菌、唾液链球菌、前庭链球菌、漫游球菌属、食窦魏斯氏菌、融合乳杆菌、赫伦魏斯氏菌、杨氏柠檬酸杆菌、红树肠杆菌、龋齿罗氏菌、粘滑罗氏菌、弗氏志贺菌、表皮葡萄球菌或乳酸菌所属亚种中的任意一种或至少两种的组合。

所述亚种可以为乳酸乳球菌的乳脂亚种、乳酸亚种、霍氏亚种；唾液乳杆菌的水杨素亚种、唾液亚种。

优选地，步骤(1)所述的培养病原菌的步骤包括活化菌种和扩大培养。

优选地，所述活化菌种的接种量为1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选为5％。

优选地，所述扩大培养为将活化的菌种转接到新鲜灭菌的LB培养基中，所述扩大培养中活化菌种的接种量为0.5-5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％或5％，优选为1％。

优选地，所述活化菌种和扩大培养的温度为30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为35-38℃，进一步优选为37℃。

优选地，所述活化菌种和扩大培养的转速为200-300rpm，例如可以是200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm或300rpm，优选为230-280rpm，进一步优选为250rpm。

优选地，所述活化菌种和扩大培养的时间为8-25h，例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、15h、16h、18h、20h、21h、23h或25h，优选为10-18h，进一步优选为12h。

优选地，所述培养乳酸菌采用多孔板进行培养。

本发明中，采用多孔板进行培养就可以同时培养多种乳酸菌，测试的时候也可以同时将多种乳酸菌进行同时测试。

优选地，步骤(2)所述的培养乳酸菌的步骤包括活化菌种、扩大培养和转接培养。

优选地，所述活化菌种的接种量为5-15％，，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，优选为10％。

优选地，所述扩大培养为将活化的菌种转接到新鲜灭菌的MRS培养基中，所述扩大培养中活化菌种的接种量为1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选为5％。

优选地，所述活化菌种和扩大培养的温度为25-33℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃，优选为28-31℃，进一步优选为30℃。

优选地，所述活化菌种和扩大培养的时间为8-25h，例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、15h、16h、18h、20h、21h、23h或25h，优选为10-18h，进一步优选为12h。

作为优选技术方案，所述转接培养为将扩大培养的菌液转接到新鲜灭菌的MRS培养基中25-33℃培养3-10h，再加入病原菌液，在25-33℃共培养8-25h。

本发明中，加入病原菌液可以诱导乳酸菌素的产生，使原本难以检测到抑菌活性的部分菌株经刺激后能产生显著的抑菌活性，增加了筛选到更多乳酸菌素的可能性。

优选地，所述将培养菌种转接到新鲜灭菌的MRS培养基中的培养条件为28-31℃培养5-8h，优选为30℃培养6h。

优选地，所述加入病原菌液后共培养的条件为28-31℃培养10-18h，优选为30℃培养12h。

优选地，所述转接培养中扩大培养菌液的接种量为1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选为5％。

优选地，所述转接培养中病原菌液的接种量为0.5-5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％或5％，优选为1％。

优选地，步骤(3)所述的LB培养基、病原菌液和乳酸菌发酵液上清的体积比为(60-100):1:(3-15)，例如可以是60:1:3、61:1:4、62:1:5、65:1:6、68:1:7、70:1:7、73:1:5、75:1:7、76:1:7、78:1:7、80:1:8、82:1:5、83:1:4、85:1:8、86:1:9、87:1:10、88:1:11、89:1:12、90:1:6、92:1:3、95:1:4、96:1:5、97:1:6、98:1:11、100:1:12，优选为(70-90):1:(6-12)，进一步优选为89:1:10。

优选地，所述共培养的时间为10-18h，优选为12h。

优选地，所述共培养的温度为30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为35-38℃，进一步优选为37℃。

优选地，所述共培养的转速为200-300rpm，例如可以是200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm或300rpm，优选为230-280rpm，进一步优选为250rpm。

优选地，所述酶标仪测量的间隔时间为1-5h，例如可以是1h、2h、3h、4h或5h，优选为1-3h，进一步优选为2h。

一种高通量筛选乳酸菌素的方法，包括如下步骤：

(1)培养病原菌：

①活化菌种：按1-10％的接种量将病原菌接种到新鲜灭菌的LB培养基中，置于30-40℃，200-300rpm条件下培养8-25h；

②扩大培养：按0.5-5％的接种量将活化的菌种接种到新鲜灭菌的LB培养基中，置于30-40℃，200-300rpm条件下培养8-25h；

(2)培养乳酸菌：

①活化菌种：按5-15％的接种量将乳酸菌接种到新鲜灭菌的MRS培养基中，置于25-33℃条件下静置培养8-25h；

②扩大培养：按1-10％的接种量将活化菌种接种到新鲜灭菌的MRS养基中，置于25-33℃条件下静置培养8-25h；

③转接培养：按1-10％的接种量将扩大培养的菌种接种到新鲜灭菌的MRS培养基中25-33℃静置培养3-10h，再以0.5-5％的接种量接入培养的病原菌液，在25-33℃静置共培养8-25h；

(3)在96孔板上将LB培养基、步骤(1)培养的病原菌发酵液和步骤(2)培养的乳酸菌发酵液上清按体积比为(60-100):1:(3-15)，在96孔板上30-40℃，200-300rpm的条件下共培养8-25h，用酶标仪每1-5h测量OD600的吸光度。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明在多孔板上进行筛选，可快速筛选出针对特定目标病原菌具有显著抑菌活性的乳酸菌素等抗菌物质，能够同时对几百株菌进行挑选，极大地提高了筛选效率；

(2)本发明通过加入病原菌液可以诱导乳酸菌素的产生，使原本难以检测到抑菌活性的部分菌株经刺激后能产生显著的抑菌活性，增加了筛选到更多乳酸菌素的可能性。

附图说明

图1为本发明抑菌筛选的效果图；

图2为本发明实施例筛选的曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

主要试剂购自上海生工生物工程有限公司；

乳酸菌菌种库：申请人前期从珠江口水产动物肠道中筛选得到乳酸菌800余株，初步建立了珠三角本地的水产养殖乳酸菌菌种资源库。

病原菌为虾致病菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802。

培养基：

(1)LB培养基

胰化蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在121℃、0.1Mpa下灭菌20min。配制固体培养基时加入琼脂粉含量为2％。

(2)MRS培养基

蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g，蒸馏水溶解并定容到1000ml，pH调至6.2-6.6，搅拌后加热，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下灭菌20min。

实施例1

一种高通量筛选乳酸菌素的方法，包括如下步骤：

(1)培养病原菌：

①活化菌种：往10mL试管中加入1.9mL灭菌LB培养基，并接入0.1mL解冻的病原菌液，置37℃、250rpm条件下培养12h；

②扩大培养：取0.25mL菌液接入25mL灭菌LB培养基的250mL三角瓶中，置37℃、250rpm条件下培养12h；

(2)培养乳酸菌：

①活化菌种：往96孔板中每孔装入540μL灭菌MRS培养基，再分别接入60μL解冻的乳酸菌液，30℃下静置培养12h；

②扩大培养：用多道移液器取出每孔30μL菌液，接入预先装有每孔570μL灭菌MRS培养基的新孔板中，30℃下静置培养12h；

③转接培养：每孔取30μL菌液，接入预先装有每孔570μL灭菌MRS培养基的新孔板中，30℃下静置培养6h，加入6μL病原菌液，继续在30℃下静置培养12h；

(3)检测：

①将培养好的96孔板置高速离心机中，10000g下离心5分钟；

②取新96孔板，分别加入178μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液和20μL乳酸菌发酵液上清，以200μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液+198μL灭菌LB培养基、20μL乳酸菌发酵液上清+180μL灭菌LB培养基为对照，设置3个重复孔板。

③置37℃、250rpm条件下培养12小时，用酶标仪测量0-12小时内没2h检测每孔的OD₆₀₀数值。

抑菌效果如图1和图2所示，其中图1是孔板的整体实验效果，图2是从图1选取3个实验孔(D7、E5、E9)及对照孔(H12)的病原菌OD₆₀₀随时间的变化曲线。从图2的曲线可以看出，与对照孔H12(不加乳酸菌发酵液上清)相比，3个实验孔所加入的乳酸菌发酵液上清均有显著的抑菌效果，其24小时抑菌活性为E9>E5>D7。

实施例2

一种高通量筛选乳酸菌素的方法，包括如下步骤：

(1)培养病原菌：

①活化菌种：往10mL试管中加入1.9mL灭菌LB培养基，并接入50μL解冻的病原菌液，置30℃、300rpm条件下培养25h；

②扩大培养：取1.25mL菌液接入25mL灭菌LB培养基的250mL三角瓶中，置30℃、300rpm条件下培养25h；

(2)培养乳酸菌：

①活化菌种：往48孔板中每孔装入1080μL灭菌MRS培养基，再分别接入120μL解冻的乳酸菌液，25℃下静置培养25h；

②扩大培养：用多道移液器取出每孔60μL菌液，接入预先装有每孔1140μL灭菌MRS培养基的新孔板中，25℃下静置培养25h；

③转接培养：每孔取60μL菌液，接入预先装有每孔1140μL灭菌MRS培养基的新孔板中，25℃下静置培养3h，加入6μL病原菌液，继续在25℃下静置培养25h；

(3)检测：

①将培养好的48孔板置高速离心机中，10000g下离心5分钟；

②取新48孔板，分别加入356μL灭菌LB培养基、4μL病原菌液和40μL乳酸菌发酵液上清，以400μL灭菌LB培养基、4μL病原菌液+396μL灭菌LB培养基、40μL乳酸菌发酵液上清+360μL灭菌LB培养基为对照，设置3个重复孔板。

③置30℃、300rpm条件下培养25小时，用酶标仪测量0-25小时内没2h检测每孔的OD₆₀₀数值。

测试结果与实施例1的结果相似，即乳酸菌发酵液上清均有显著的抑菌效果。

实施例3

一种高通量筛选乳酸菌素的方法，包括如下步骤：

(1)培养病原菌：

①活化菌种：往10mL试管中加入1.8mL灭菌LB培养基，并接入0.2mL解冻的病原菌液，置40℃、200rpm条件下培养8h；

②扩大培养：取0.125mL菌液接入25mL灭菌LB培养基的250mL三角瓶中，置40℃、200rpm条件下培养8h；

(2)培养乳酸菌：

①活化菌种：往96孔板中每孔装入570μL灭菌MRS培养基，再分别接入30μL解冻的乳酸菌液，33℃下静置培养8h；

②扩大培养：用多道移液器取出每孔60μL菌液，接入预先装有每孔540μL灭菌MRS培养基的新孔板中，33℃下静置培养8h；

③转接培养：每孔取60μL菌液，接入预先装有每孔510μL灭菌MRS培养基的新孔板中，33℃下静置培养6h，加入30μL病原菌液，继续在33℃下静置培养8h；

(3)检测：

①将培养好的96孔板置高速离心机中，10000g下离心5分钟；

②取新96孔板，分别加入178μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液和20μL乳酸菌发酵液上清，以200μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液+178μL灭菌LB培养基、20μL乳酸菌发酵液上清+180μL灭菌LB培养基为对照，设置3个重复孔板；

③置40℃、200rpm条件下培养8小时，用酶标仪测量0-8小时内没2h检测每孔的OD₆₀₀数值。

测试结果与实施例1的结果相似，即乳酸菌发酵液上清均有显著的抑菌效果。

实施例4

一种高通量筛选乳酸菌素的方法，包括如下步骤：

(1)培养病原菌：

①活化菌种：往10mL试管中加入1.8mL灭菌LB培养基，并接入0.2mL解冻的病原菌液，置40℃、200rpm条件下培养8h；

②扩大培养：取0.125mL菌液接入25mL灭菌LB培养基的250mL三角瓶中，置40℃、200rpm条件下培养8h；

(2)培养乳酸菌：

①活化菌种：往96孔板中每孔装入510μL灭菌MRS培养基，再分别接入90μL解冻的乳酸菌液，28℃下静置培养12h；

②扩大培养：用多道移液器取出每孔6μL菌液，接入预先装有每孔594μL灭菌MRS培养基的新孔板中，28℃下静置培养12h；

③转接培养：每孔取6μL菌液，接入预先装有每孔574μL灭菌MRS培养基的新孔板中，28℃下静置培养8h，加入20μL病原菌液，继续在28℃下静置培养12h；

(3)检测：

①将培养好的96孔板置高速离心机中，10000g下离心5分钟；

②取新96孔板，分别加入178μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液和20μL乳酸菌发酵液上清，以200μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液+178μL灭菌LB培养基、20μL乳酸菌发酵液上清+180μL灭菌LB培养基为对照，设置3个重复孔板；

③置40℃、200rpm条件下培养12小时，用酶标仪测量0-12小时内没2h检测每孔的OD₆₀₀数值。

测试结果与实施例1的结果相似，即乳酸菌发酵液上清均有显著的抑菌效果。

实施例5

一种高通量筛选乳酸菌素的方法，包括如下步骤：

(1)培养病原菌：

①活化菌种：往10mL试管中加入1.9mL灭菌LB培养基，并接入0.1mL解冻的病原菌液，置37℃、250rpm条件下培养12h；

②扩大培养：取0.25mL菌液接入25mL灭菌LB培养基的250mL三角瓶中，置37℃、250rpm条件下培养12h；

(2)培养乳酸菌：

①活化菌种：往96孔板中每孔装入540μL灭菌MRS培养基，再分别接入60μL解冻的乳酸菌液，30℃下静置培养12h；

②扩大培养：用多道移液器取出每孔30μL菌液，接入预先装有每孔570μL灭菌MRS培养基的新孔板中，30℃下静置培养12h；

③转接培养：每孔取30μL菌液，接入预先装有每孔570μL灭菌MRS培养基的新孔板中，30℃下静置培养6h，加入6μL病原菌液，继续在30℃下静置培养12h；

(3)检测：

①将培养好的96孔板置高速离心机中，10000g下离心5分钟；

②取新96孔板，分别加入188μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液和10μL乳酸菌发酵液上清，以200μL灭菌LB培养基、2μL病原菌液+198μL灭菌LB培养基、10μL乳酸菌发酵液上清+190μL灭菌LB培养基为对照，设置3个重复孔板。

③置37℃、250rpm条件下培养12小时，用酶标仪测量0-12小时内没2h检测每孔的OD₆₀₀数值。

测试结果与实施例1的结果相似，即乳酸菌发酵液上清均有显著的抑菌效果。

对比例1

该对比例于实施例1的不同之处仅在于，所述培养乳酸菌中的转接培养时没有接入病原菌液，除此之外，其余试剂和试剂用量以及培养方法均与实施例1相同。

结果显示，在没有接入病原菌液时，部分乳酸菌发酵液上清抑菌效果不明显。由此说明，本发明在乳酸菌培养过程中加入少量病原菌能刺激乳酸菌产生相应的抗菌物质(乳酸菌素)，因而能筛选到由传统方法不容易得到的乳酸菌素。

对比例2

该对比例于实施例1的不同之处仅在于，所述培养乳酸菌中的转接培养时接入病原菌液的接种量超过了5％，即接种量为8％，除此之外，其余试剂和试剂用量以及培养方法均与实施例1相同。

结果显示，当病原菌液接入量过大时，乳酸菌的生长极其缓慢，即生长受到了抑制。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。