用于枣黑斑病菌检测的引物及检测方法与流程

本发明涉及枣黑斑病链格孢菌检测引物及其检测方法，专用于红枣主产区枣黑斑病链格孢菌的快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间枣黑斑病链格孢菌的早期诊断和病害田间发生侵染的动态监测与鉴定，属于林果病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术：

枣黑斑病病原菌为Alternaria alternate,该病原菌致病性强，传播迅速，具有爆发性的发生特点，常常在枣果和叶片上形成黑斑，病果果肉变褐色，并向内部延伸。自2008年枣黑斑病在新疆发生以来，在新疆红枣主产区主栽的骏枣上危害最为严重。目前该病在新疆红枣主产区均有不同程度的发生，一般枣园平均发病率在10％-30％左右，严重地块发病率高达90％，甚至造成绝收，极大的影响了疆红枣的产量和品质。

在新疆，由于该病是一种新病害，加之病原为弱寄生菌(A.alternata)引起，而很难设计出特异性引物，病害的检测多采用传统的检测方法，包括发病症状观察或分离得到病原物后再进行形态学鉴定。然而由于枣黑斑病潜伏期长，在未表现出症状的情况下，直接观察会提供错误的判断。病原菌的形态学鉴定容易受人为因素和环境条件的干扰，加之传统的分类方法熬时长、程序繁琐，不适合快速检测的要求，很难实现对病害发生的及时监测和有效控制病原菌的传播和病害流行。因此，本专利是在明确新疆枣黑斑病是由A.alternata侵染引起的基础上，建立了枣黑斑病菌(A.alternata)快速检测体系，在红枣整个生育期对植株、枝叶和果实等进行病原菌的田间追踪检测以及针对落叶、落果、枯枝等病残体及土壤是否携带链格孢菌霉菌进行快速准确的检测，对于探索病害防控的关键点以及病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行蔓延以及减少病害造成的经济损失具有重要的理论和实际意义。

技术实现要素：

在红枣主产区枣黑斑病危害严重、病害潜伏期长，常规的监测技术手段难以做到对病害发生的及时监测的问题，本发明是在准确鉴定病原的基础上，针对特定病原靶标发明了一种针对红枣主产区枣黑斑病菌的检测引物及其检测方法，利用本发明所述的检测引物和检测方法检测枣黑斑病菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、快速且结果可靠。

发明的技术方案为：

用于枣黑斑病菌检测的引物，所述的引物的序列为：上游引物Alt-F:5’-GTATCTCTGCTAAGAACGCTCTCG-3’，下游引物Alt-R:5’-GCTGAGACTCGTACTCGTCCTT-3’。

枣黑斑病菌的检测方法，步骤如下：

(1)采用CTAB法提取样本总DNA；

(2)扩增检测：利用权利要求1所述的引物进行扩增；

(3)取扩增的产物5μl进行琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据条带的有无及大小对枣黑斑病菌有无进行鉴定。

优选的，所述的步骤(2)中的扩增是PCR扩增。

优选的，枣黑斑病菌的检测方法，所述的采用CTAB法提取样本总DNA，步骤为：

(1)新鲜感病叶片和/或果实切成块，放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成细粉；

(2)取未解冻细粉到离心管，加入等体积的CTAB提取缓冲液，65℃水浴20分钟，其间颠倒摇动3-5次；

(3)加入等体积的氯仿和/或异戊醇，混匀，室温下10000-15000r/min离心15-25分钟；

(4)将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿和/或异戊醇，颠倒混匀，室温，10000-15000r/min离心10-15分钟；

(5)将上层水相转入新的离心管，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置20-30分钟；

(6)10000-15000r/min离心5-15分钟，去上清液，70％乙醇漂洗，沉淀

吹干，加入TE缓冲液，-20℃保存备用。

所述的枣黑斑病菌的检测方法：PCR反应体系为25μl，包括2.5μL 10×Buffer缓冲液，25μMdNTPs，0.1μM引物，0.5U Taq DNA聚合酶和10ng DNA模板，无菌超纯水补足。

所述的枣黑斑病菌的检测方法，扩增程序为80-96℃预变性2-4min，80-96℃变性20-50s，50-70℃退火延伸40-50s，共30-40个循环，最后延伸7-15min。

优选的，所述的扩增程序为94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火延伸45s，共35个循环，最后延伸10min。

所述的引物的用途，用于枣黑斑病菌的检测。

所述的引物的用途，用于新疆枣黑斑病菌的检测。

所述的枣黑斑病菌检测的试剂盒，所属的试剂盒包含如权利要求1所述的引物。

本发明的有益效果：

本发明是针对红枣主产区枣黑斑病菌开发设计的特异性引物，建立了病原菌的分子检测技术体系。发明的分子检测技术体系不但可以作为病原菌鉴定的辅助手段，同时还可以应用于病害田间发生与侵染动态的田间追踪检测，对明确病害的侵染规律，探索病害防控的关键点具有重要应用价值。

本发明所设计的引物具有很强的特异性和更高的准确性，可以直接提取田间样本总DNA，进行引物特异性PCR检测和鉴定。传统的枣黑斑病菌的检测方法一般是在植物出现症状后，借助其发病症状，对病原菌进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，而本发明中设计的特异性引物和检测方法，灵敏度高，可在病害侵染后的潜伏期内实现病原菌的快速检测，省略了样本采集后的分离、纯化和鉴定等步骤。

本发明解决了传统方法不能在病害发病前期及时进行田间病害发生与侵染的动态监测和检测，常给病害防治造成延误的问题。因此，本发明可用于链格孢菌引起病害显症之前的早期监测，可为确定病害防治最佳时期和防治策略的制定提供科学依据。

附图说明

图1：为本发明所要检测的枣黑斑病菌的特异性PCR扩增图，图中：泳道M为100bp Marker；泳道1-4为链格孢菌(A.alternata)；泳道5-18分别为：Alternaria fasciculata；Alternaria rugosa；Alternaria tenuis；Alternaria alternantherae；Alternaria conjuncta；Alternaria zinniae；Alternaria solani；Alternaria infectoria；Alternaria longipes；Rhizopus stolonifer；Fusarium oxysporum；Aspergillus oryzae；Penicillium glaucum；Cladosporium cladosporioides；CK为阴性对照。

图2：为本发明枣黑斑病菌的灵敏性检测扩增结果图，图中泳道M为100bp Marker，泳道1为10ng，泳道2为1ng，泳道3为100pg，泳道4为10pg，泳道5为1pg，泳道6为100fg，泳道7为10fg，泳道8为1fg，泳道9为100ag。

图3：为本发明发病组织的检测结果图，图中泳道M为100bp Marker，泳道1为阳性对照，泳道2-3为病果，泳道4-5为病叶，泳道6-7为表层土壤中病残体混合物，泳道8-9为树下病残叶，泳道10-11为树下病残果，泳道12为健康的枣果组织，13为健康的叶片组织，CK为阴性对照。

具体实施方式

通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地理解本发明,但下述实施例并不是对本发明的限定。以下实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，本领域的技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。下列实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例1:PCR检测引物序列的设计及引物对枣黑斑病菌的特异性扩增

1.引物的设计与合成

根据GenBank中公布的链格孢属不同种间hsp70基因序列进行比对分析，利用Primer Premer5设计出对链格孢菌(A.alternata)具有特异性扩增作用的一对引物，引物序列为：上游引物Alt-F:5’-GTATCTCTGCTAAGAACGCT-CTCG-3’下游引物Alt-R:5’-GCTGAGACTCGTACTCGTCCTT-3’，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2.供试菌株基因组的提取

采用CTAB法提取真菌基因组DNA，具体步骤如下：

1)将震荡培养5天的真菌菌丝抽滤冻干，取50mg菌丝于液氮中研成粉。

2)将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积(w/v)2×CTAB提取缓冲液，65℃保温20分钟，其间不时颠倒摇动3-5次。

3)加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下12000r/min离心15分钟。

4)将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温12000r/min离心10分钟。

5)将上层水相转入新的2ml灭菌的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置30分钟。

6)4000r/min离心10分钟，去上清液，70％乙醇漂洗，沉淀吹干。

7)风干后加入50ul的TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

3.引物特异性验证

以供试的枣黑斑病菌及其它病原菌的基因组为模板，对枣黑斑病菌特异性引物(上游引物Alt-F:5’-GTATCTCTGCTAAGAACGCTCTCG-3’，下游引物Alt-R:5’-GCTGAGACTCGTACTCGTCCTT-3’)的特异性进行验证。PCR反应体系为25μl，包括2.5μL 10×Buffer缓冲液(TransGen Biotech,Beijing,China)，25μM dNTPs，0.1μM引物(Alt-F/Alt-R)，0.5U Taq DNA聚合酶和10ng DNA模板，不足部分加无菌超纯水不足。扩增程序为94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火延伸45s，共35个循环，最后延伸10min。取PCR产物5μL进行琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据条带的有无及大小对枣黑斑病菌特异性引物的特异性进行验证。

4.引物特异性验证结果

扩增结果表明，引物只能特异性地从供试的4个枣黑斑病菌中扩增出大小约为181bp的条带，而其它14个不同种属的供试菌株及阴性对照均无扩增条带。说明该对引物均可以将枣黑斑病菌(A.alternata)与其它链格孢菌和病原真菌区分开来，具有种的特异性，可用于更枣黑斑病菌快速可靠的检测和鉴定。

实施例2：引物对枣黑斑病菌基因组的灵敏度检测

利用上述反应体系进行定性扩增(图2)，从图2可知，当含量为100ag/μl时，所设计的引物仍然能检测出181bp的目的条带，说明该特异性引物最低检测极限灵敏度可以达到100ag/μl，可以满足目前的定性检测需要。

实施例3：发病枣果、叶片及病残体组织中枣黑斑病菌(A.alternate)的检测

采用CTAB法提取样本总DNA，具体过程如下：

1)将新鲜感病叶片/果实(100mg)在研钵中加入液氮充分研磨成细粉。

2)取50mg转移细粉到一个2.0ml离心管，不要解冻，立即加入等体积(w/v)2×CTAB提取缓冲液，65℃保温20分钟，其间不时颠倒摇动3-5次。

3)加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下12000r/min离心20分钟。

4)将上清液转入另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温12000r/min离心15分钟。

5)将上层水相转入新的2ml灭菌的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，室温下放置30分钟。

6)5000r/min离心10分钟，去上清液，70％乙醇漂洗，沉淀吹干。

7)风干后加入50ul的TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

扩增检测：利用本发明所述引物进行扩增。以供试的枣黑斑病菌及其它病原菌的基因组为模板，对枣黑斑病菌特异性引物(上游引物Alt-F:5’-GTATCTCTGCTAAGAACGCTCTCG-3’，下游引物Alt-R:5’-GCTGAGACTCGTACTCGTCCTT-3’)的特异性进行验证。PCR反应体系为25μl，包括25μl，包括2.5μL 10×Buffer缓冲液(TransGen Biotech,Beijing,China)，25μM dNTPs，0.1μM引物(Alt-F/Alt-R)，0.5U Taq DNA聚合酶和10ng DNA模板，不足部分加无菌超纯水不足。扩增程序为94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火延伸45s，共35个循环，最后延伸10min。取PCR产物5μl进行琼脂糖电泳检测，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据条带的有无及大小对枣黑斑病菌有无进行鉴定，依据图3，可知，应用本文中所设计的引物对和反应体系，能够快速检测和鉴定枣黑斑病菌，同时可应用于病害侵染循环研究。