耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株、在合成苯基乳酸中的应用及其合成方法与流程

本发明涉及一种耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株，属于生物技术领域。本发明还涉及上述突变株在合成苯基乳酸中的应用，以及合成苯基乳酸的方法。

背景技术：

苯基乳酸(PLA)是一种含有一个手性碳原子的有机酸，其普遍存在于乳酸菌发酵产品中，结构属于苯丙素类化合物。众多研究表明该化合物具有显著的广谱抑菌效果，可以有效抑制包括食源性致病细菌、酵母和霉菌等多种微生物的生长。并且可以作为合成多种药物的中间体以及可降解聚合物的单体，在饲料添加剂、医药、化妆品等多方面都具有广泛的应用前景。

因苯基乳酸为手性化合物，为获得高光学纯度的PLA，目前为止，主要的途径是利用微生物为载体，构型专一性的酶催化合成相应构型PLA。其中合成强度最高的方法主要是采用大肠杆菌为宿主，过量表达不同来源的脱氢酶催化苯丙酮酸(PPA)还原合成PLA。尽管该方法能够在短时间内合成较高浓度的PLA，但是由于PLA本身具有较好的抑菌效果。有资料表明PLA主要通过破坏细胞壁和细胞膜使得细胞膨大、絮凝导致死亡。在PLA积累到一定浓度后，细胞将很快失去活力，导致PLA合成速率迅速下降甚至完全停止。因此，生产菌株对于产物PLA较差的耐受性是该技术的一个重要缺陷和瓶颈。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株耐受PLA的大肠杆菌突变株、利用上述突变株合成苯基乳酸中的应用，以及合成苯基乳酸的方法。

为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：

耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株(大肠杆菌Z2016，Escherichiacoli Z2016)于2016年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2016332。

上述耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株在合成苯基乳酸中的应用。

利用上述耐受苯基乳酸的大肠杆菌突变株合成苯基乳酸的方法，包括以下步骤：

(1)感受态细胞的制备

1)挑取活化后的E.coli BL21(DE3)在LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养；

2)按照1％接种活化菌液于BT培养基中，于16℃、250rpm培养至菌液OD₆₀₀＝0.6；

3)将培养菌液转移到灭菌预冷的聚丙烯塑料离心管中，冰上放置10min后于4℃、4000rpm离心5min；

4)弃上清液，每50mL培养物菌体沉淀用5mL冰上预冷的BT Buffer F充分重悬菌体，冰上放置15min；

5)于4℃、4000rpm离心5min收集菌体，用2mL冰上预冷的BT Buffer E充分重悬菌体，按每管100μL分装到冰上预冷的1.5mL离心管中，制备好的感受态用于转化或-86℃冰箱中保存；

(2)质粒转化感受态细胞

1)将10μL质粒连接液加入至100μL感受态细胞中，轻弹混匀充分，冰浴30min-40min；

2)将离心管置于42℃金属浴中热激60-90s后，将离心管取出后立即放置冰上2min-3min；

3)加入预热好的37℃的LB液体培养基890μL，37℃振荡培养60min；

4)将转化液4000rmp离心2min，吸出750μL上清液；

5)在提前配置好的含有卡那霉素的LB平板培养基中加入20μL的IPTG，使用无菌的涂布棒将其均匀的涂开；

6)将剩下的菌液轻轻混匀后均匀涂布到转化平板上，待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时；

7)挑取单菌落利用菌落PCR、酶切方法筛选出符合要求的阳性克隆，进行DNA测序验证；

(3)重组突变菌株全细胞合成PLA

将活化的重组突变菌按1％的接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基的摇瓶中，37℃、200rpm恒温振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度1.0mmol/L IPTG 25℃诱导培养8h后，4℃、6000rpm离心10min收集菌体，菌体用pH 7.0磷酸缓冲液洗涤2次，重悬于100mL缓冲液，含有2％葡萄糖和12g/L底物，定时取样进行HPLC检测，当PPA消耗后补加6mL 200g/L PPA，反应120min。

本发明通过紫外诱变筛选一株耐受PLA的大肠杆菌，并将其分别应用于合成D-PLA和L-PLA，达到了显著提高目标物产量的目的。

附图说明

图1为不同PLA浓度胁迫下对E.coli BL21(DE3)存活率的影响。

图2为突变菌株(MT:E.coli Z2016)与原始菌株(WT:E.coli BL21(DE3))在含1g/L PLA的筛选培养基上的单菌落。

图3为PLA胁迫对原始菌株(WT:E.coli BL21(DE3))与突变菌株(MT:E.coli Z2016)生长情况的影响。

图4为PLA胁迫对突变菌株(MT:E.coli Z2016)与原始菌株(WT:E.coli BL21(DE3))的活力的影响。

图5为重组突变菌E.coli(Z2016)pET-28a-ldh^Y52V合成D-PLA时间曲线图。

图6为出发重组菌株E.coli pET-28a-ldh^Y52V合成D-PLA时间曲线图。

图7为重组突变菌E.coli(Z2016)pET-28a-ldhL合成L-PLA时间曲线图。

图8为出发重组菌株E.coli pET-28a-ldhL合成L-PLA时间曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

紫外诱变筛选耐受性菌株：

菌液用生理盐水稀释至1×106CFU/mL左右，取2mL倒入无菌培养皿中，在预热20min的紫外灯(紫外灯的功率为10W，照射距离为20cm左右)下照射60s，吸取0.2mL诱变菌液接种至10mL LB培养基，37℃、200rpm暗培养12h，吸取0.1mL涂布筛选培养基(含1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L PLA的LB培养基)倒置培养12h，记录单菌落生长情况，能够在筛选培养基生长出的单菌落视为突变菌株。

在含1g/L PLA的LB培养基上，原始菌株基本不能正常长出单菌落，突变菌株能够正常长出单菌落，且形态良好。突变菌株命名为Escherichia coli Z2016，该菌株于2016年6月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2016332。

菌株的特性：该菌株由Escherichia coli BL21(DE3)经诱变获得，属于大肠杆菌B株。革兰氏染色阴性，杆菌。大小0.7μm×1μm，能运动，LB培养基上菌落较小，半透明。基因型为fhuA2[lon]ompT gal(λDE3)[dcm]ΔhsdSλDE3＝λsBamHIoΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7gene1)i21Δnin5。

PLA胁迫对E.coli BL21(DE3)存活率的影响：

将活化后的E.coli BL21(DE3)以1％的接种量接种至LB培养基，37℃，200rpm震荡培养12h。离心收集菌体，经pH 7.0磷酸盐缓冲液冲洗两次并重悬。菌液经无菌生理盐水稀释至10⁶CFU/mL,分别取100μL接种至含有0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L D-PLA的筛选培养基中，37℃培养12h，分别测定不同浓度的PLA胁迫下菌株的存活率。0g/L PLA即未胁迫下单菌落个数记为100％，存活率＝(不同浓度胁迫下存活的单菌落数/未胁迫下单菌落数)×100％。

如图1所示，在不含D-PLA即0g/L PLA浓度胁迫下，大肠杆菌存活率为100％，增加PLA浓度，大肠杆菌的存活率迅速降低，当PLA的浓度为0.5g/L时，大肠杆菌的存活率为47.3％，1g/L PLA胁迫时，大肠杆菌的存活率为5.56％，继续增加PLA浓度，大肠杆菌存活率为0。

PLA胁迫对突变菌株与原始菌株的影响：

1、PLA胁迫对菌株生长的影响

将出发菌株及突变菌株活化后分别以1％的接种量接种至含0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L D-PLA的100mL LB培养基，37℃，200rpm震荡培养。定时取样稀释，测定OD₆₀₀。

由图3看出，突变菌株与原始菌株在不含PLA的培养基正常生长，且到达稳定期时OD₆₀₀数值基本一致；在1g/L PLA胁迫时，原始菌株几乎不能生长，突变菌株能够正常生长，如图2所示；2g/L PLA胁迫时，突变菌株也有部分能够生长，当达到稳定期时，OD₆₀₀比1g/LPLA条件下有所降低。通过诱变得到的突变菌株比原始出发菌株能够耐受更高浓度的PLA。

PLA胁迫对菌株活力的影响：

生长至稳定期的菌体细胞经PBS缓冲液冲洗后重悬，加入不同浓度PLA进行胁迫，定时取适量胁迫后的菌液，12000rpm离心5min,用PBS缓冲液冲洗两次，加入30μL 5g/L MTT溶液，充分混匀后于30℃恒温金属浴30min，后12000rpm离心10min，弃去上清，加入300μL DMSO，震荡培养10min后12000rpm离心10min，取200μL上清液于96孔板中，在490nm处测吸光值。以未胁迫的细胞活力记为100％，细胞活力＝胁迫后吸光值/胁迫前吸光值×100％。

结果显示在图4，随着胁迫浓度增大，突变菌株与原始菌株活力降低越快。相同胁迫浓度下，突变菌株比原始菌株活力降低较慢。突变菌株与原始菌株相比，对PLA的耐受能力提高。

实施例2

构建重组突变菌：

1、感受态细胞的制备

(1)挑取活化后的E.coli BL21(DE3)在10mL LB液体培养基中37℃、200rpm过夜培养(约10h)。

(2)按照1％接种活化菌液于50mL BT培养基中，于16℃、250rpm培养至菌液OD₆₀₀＝0.6(或≈0.6)。

(3)将培养菌液转移到灭菌预冷的聚丙烯塑料离心管中，冰上放置10min后于4℃、4000rpm离心5min。

(4)弃上清液，每50mL培养物菌体沉淀用5mL冰上预冷的BT Buffer F轻轻充分重悬菌体，冰上放置15min。

(5)于4℃、4000rpm离心5min收集菌体，用2mL冰上预冷的BT Buffer E轻柔充分重悬菌体，按每管100μL分装到冰上预冷的1.5mL离心管中。制备好的感受态用于转化或-86℃冰箱中保存。

2、质粒转化感受态细胞

(1)将10μL质粒连接液(pET-28a-ldh^Y52V、pET-28a-ldhL)加入至100μL上述感受态细胞中，轻弹混匀充分，冰浴30min-40min。

(2)将离心管置于42℃金属浴中热激60-90s后，将离心管取出后立即放置冰上2min-3min，期间不要摇动离心管。

(3)加入预热好的37℃的LB液体培养基890μL，37℃振荡培养60min。

(4)将转化液4000rmp离心2min，吸出750μL上清液。

(5)在提前配置好的含有卡那霉素的LB平板培养基中加入20μL的IPTG，使用无菌的涂布棒将其均匀的涂开。

(6)将剩下的菌液轻轻混匀后均匀涂布到转化平板上，待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。

(7)挑取单菌落利用菌落PCR、酶切等方法筛选出符合要求的阳性克隆，进行DNA测序验证。

重组突变菌株全细胞合成PLA：

将活化的重组突变菌E.coli(Z2016)pET-28a-ldh^Y52V、E.coli(Z2016)pET-28a-ldhL和对照E.coli pET-28a-ldh^Y52V、E.coli pET-28a-ldhL按1％的接种量接种到装有100mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)的摇瓶中，37℃、200rpm恒温振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度1.0mmol/L IPTG25℃诱导培养8h后，4℃、6000rpm离心10min收集菌体，菌体用pH 7.0磷酸缓冲液洗涤2次，重悬于100mL缓冲液(细胞浓度为30g/L)，含有2％葡萄糖和12g/L底物，定时取样进行HPLC检测，当PPA消耗后补加6mL 200g/L PPA，反应120min。

HPLC检测PLA与PPA方法：色谱条件：高效液相色谱仪为日本岛津公司生产的LC-20A，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H有机酸分析柱；流动相为5mmol/L稀硫酸；流速0.6mL/min；柱温30℃；进样体积5μL，检测波长210nm。

重组突变菌E.coli(Z2016)pET-28a-ldh^Y52V与对照菌E.coli pET-28a-ldh^Y52V在相同条件下进行分批补加底物合成D-PLA，如图5、6所示，反应120min后，重组突变菌得到D-PLA的产量为25.37g/L，比对照组21.75g/L提高了16.64％，且在反应120min后，对照组细胞活力降低，PLA产量增加较小，而重组突变菌仍有一定程度的增长趋势。

图7、8为重组突变菌E.coli(Z2016)pET-28a-ldhL与对照菌E.coli pET-28a-ldhL相同条件下合成L-PLA的时间曲线。反应120min，重组突变菌得到L-PLA的浓度为26.59g/L，较对照组23.53g/L提高了13.02％。与对照组相比，反应120min后，重组突变株合成PLA仍有一定的增长。突变菌株耐受PLA的能力增加，重组突变株合成的PLA产量增高。

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。