一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3及其应用的制作方法

本发明涉及一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术：

罂粟碱是罂粟壳的主要成分之一。罂粟壳是罂粟的干燥成熟果壳，具有药用价值，但久服易成瘾，对人体的肝脏、心脏、神经系统具有毒害作用。由于其易成瘾性，有些不法商贩将其加入到食品中，例如火锅底料、方便面调料等，以达到吸引顾客、牟取暴利的目的。为此，国家药品监督管理局将罂粟碱列入麻醉药品管制品种，通过检测罂粟壳中含有的吗啡和罂粟碱等主要成分以实现对罂粟壳使用情况的监督。

为了有效监督监测食品中使用罂粟壳情况，需要寻找一种特异性好、灵敏度高的测定方法，而目前检测方法如薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法等，分离纯化过程冗长，灵敏度低，加上食品中干扰物多，难以获得准确结果。因此建立快速简便的罂粟碱检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆单体是重要前提。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3，由该细胞株制备的抗体对罂粟碱具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立罂粟碱的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.12031。

所述罂粟碱单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No.12031的罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3分泌产生。

所述罂粟碱单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中罂粟碱残留的分析检测。

本发明提供的罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3的制备基本步骤为：

（1）半抗原的合成：

将化合物1（2g，5.89mmol）溶解在48％溴化氢（10mL）中，55℃下搅拌过夜，向溶液中加入水并用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型高效液相色谱纯化粗产物，得到化合物2（700mg，36.6％）。

将化合物2（700mg，2.15mmol）溶解在乙腈（10mL）和2-溴乙酸乙酯（536mg，3.23mmol）的溶液中，加入碳酸钾（595mg，4.31mmol），并在室温下搅拌过夜。向溶液中加入水并用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。 通过制备型高效液相色谱纯化粗产物，得到化合物3（100mg，11.3％）

将化合物3（100mg，0.24mmol）溶解在四氢呋喃（3mL）和水（2mL）中，加入氢氧化锂（25.5mg，0.61mmol），并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过制备型高效液相色谱纯化，得到半抗原PAPA（30mg，32.3％）；

（2）完全抗原PAPA-KLH的制备：称取4mg PAPA，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）7mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）4mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。取匙孔血蓝蛋白KLH 1mL(6.8mg/mL)，加入等体积硼酸缓冲溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PAPA-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（3）小鼠的免疫：PAPA-KLH完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫用罂粟碱完全抗原与等量完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用PAPA-KLH完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；

（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3；

（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

取高效价低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。

本发明的有益效果：本发明提供的细胞株YH3分泌的单克隆抗体，对罂粟碱具有较好的特异性和检测灵敏度（IC₅₀值为0.1ng/mL），可实现对水、果蔬、谷物中罂粟碱残留量的检测，为食品中罂粟碱残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2016年1月20日，保藏编号为CGMCC No. 12031，分类命名为单克隆细胞株。

附图说明

图1是YH3单克隆抗体对罂粟碱的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将罂粟碱完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对罂粟碱有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1 杂交瘤细胞株YH3的制备

（1）半抗原的合成：将化合物1（2g，5.89mmol）溶解在48％溴化氢（10mL）中，55℃下搅拌过夜，向溶液中加入水并用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型高效液相色谱纯化粗产物，得到化合物2（700mg，36.6％）。

将化合物2（700mg，2.15mmol）溶解在乙腈（10mL）和2-溴乙酸乙酯（536mg，3.23mmol）的溶液中，加入碳酸钾（595mg，4.31mmol），并在室温下搅拌过夜。向溶液中加入水并用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。 通过制备型高效液相色谱纯化粗产物，得到化合物3（100mg，11.3％）。

将化合物3（100mg，0.24mmol）溶解在四氢呋喃（3mL）和水（2mL）中，加入氢氧化锂（25.5mg，0.61mmol），并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过制备型高效液相色谱纯化，得到半抗原PAPA（30mg，32.3％）。

（2）完全抗原的合成：称取4mg PAPA，EDC 7mg，NHS 4mg，用300μL无水DMF溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h。取KLH 1mL(6.8 mg/mL)，加入等体积BB溶液（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PAPA-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。

（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取罂粟碱完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

（4）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞： 融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO₂培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 1~ 4×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 1500 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5 min。 离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用罂粟碱为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对罂粟碱标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株YH3。

（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

6.1包被：将包被原PAPA-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；

6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

6.3封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃反应2h；洗涤后烘干备用；

6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL /孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；

6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体罂粟碱的IC₅₀为0.1 ng/mL，说明对罂粟碱有很好的灵敏度，可用于罂粟碱免疫分析检测。

溶液的配置：碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59 g，NaHCO₃ 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05 % 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄^.12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。