一种单克隆抗体及其制备方法与流程

本发明属于医药学技术领域，尤其涉及一种单克隆抗体及其制备方法。

背景技术：

抗体的主要功能是与抗原(包括外来的和自身的)相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，尤其是单克隆抗体，由于其高度均一、针对某一特定抗原表位，因此，广泛用于免疫学分析、放射免疫显像和免疫导向治疗等领域。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。鼠源性单克隆抗体：鼠杂交瘤单克隆抗体主要是将来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。

嵌合性单克隆抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等。

人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段(互补决定区，CDR)与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。

全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术、转基因小鼠抗体制备技术和单个B细胞抗体制备技术等。

由人源化和全人源抗体制备的人源化和全人源抗体药物因其具有高亲和力、高特异性、毒副作用小的特点，克服了动物源抗体及嵌合抗体的各种缺点，已经成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势。

现有技术中一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)传染病病原体抗原的制备：以常规方法在真核或原核细胞中生产并纯化重组传染病病原体抗原蛋白；(2)抗体的标记：将上步纯化的重组传染病病原体抗原蛋白以荧光或生物素标记；(3)B细胞的获取、富集与纯化：从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；(4)标记抗原与特异性B细胞的结合：将步骤(2)中标记的重组传染病病原体抗原蛋白与步骤(3)中的B细胞进行特异性结合；(5)抗原特异性B细胞的获取：根据标记，以流式细胞仪筛选、分离出上步中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；(6)扩增抗体可变区基因：采用特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；(7)构建表达载体：将上步所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA；(8)重组抗体表达与纯化：以上步纯化后的表达载体DNA转染真核细胞，培养使其获得表达后经分离纯化得重组抗体。

综上所述，现有技术抗体不具有高亲和力、不具有高特异性、毒副作用大，现有技术制备方法中获得的重组抗体浓度偏低，成本高，不适合工业上的大规模生产应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种单克隆抗体及其制备方法，旨在解决现有技术抗体不具有高亲和力、不具有高特异性、毒副作用大，现有技术制备方法中获得的重组抗体浓度偏低，成本高，不适合工业上的大规模生产应用的问题。

本发明是这样实现的，一种单克隆抗体，该单克隆抗体包括抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11；

所述抗PGAM的核苷酸序列为SEQ ID NO1；

所述CoIα的核苷酸序列为SEQ ID NO2；

所述Trx的核苷酸序列为SEQ ID NO3；

所述PGAM13的核苷酸序列为SEQ ID NO4；

所述CoIα12的核苷酸序列为SEQ ID NO5；

所述Trx11的核苷酸序列为SEQ ID NO6。

本发明另一目的在于提供一种单克隆抗体的制备方法，该单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

通过脾内包埋用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11免疫小鼠；

取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；

用间接ELISA法检测细胞培养上清。

通过脾内包埋用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11免疫小鼠方法为：

(1)将高压灭菌过的滤纸片剪成1mm×3mm大小纸条，浸入免疫原PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-KLH、CoIα12-KLH、Trx11-KLH液体中；

(2)用小鼠板固定小鼠，眼眶采血后打开腹腔；

(3)游离脾脏，将滤纸条植入脾脏内；

(4)关腹，缝合，创可贴包扎切口；

(5)将小鼠松开，标记免疫时间、免疫原名称、操作者，单独放入小鼠笼内饲养；

(6)一周后腹部皮下加强免疫一次。

进一步，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合前需进行：

SP2/0细胞的准备，包括以下步骤：

1)取1管冻存的SP2/0细胞，置于37℃水浴1min，用滴管移入10ml离心管内加入5ml不全1640培养液，1500rpm离心5min，弃上清；

2)加入5ml完全1640培养液，重悬细胞，移入细胞培养瓶，置37℃二氧化碳培养箱培养；

3)于融合前48小时～36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养；

4)融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管内；

5)1500rpm离心5min，弃去上清；

6)加入30ml不完全培养液，1500rpm离心5min，弃去上清；

7)加入10ml不完全培养液重悬细胞；

8)取细胞悬液行细胞计数；细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml不全1640培养液中，混匀，用血球计数板计数；

计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数＝4个大方格细胞数×10⁵/4；或每毫升细胞数＝5个中方格细胞数×10⁶/2。

进一步，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合前还需进行：

制备免疫脾细胞悬液：包括以下步骤：

(a)取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；

(b)通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养液的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织；

(c)将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养液的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏或用注射器内芯挤压脾脏，使脾细胞进入平皿中的不完全培养液；用吸管吹打数次，制成单细胞悬液；用200目铜网过滤；

(d)收获脾细胞悬液，1500rpm离心5min，用不完全培养液离心洗涤3次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养液；

(e)取上述悬液，行细胞计数后备用；通常每只小鼠可获得1×10⁸～2.5×10⁸个脾细胞。

进一步，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合前还需进行：

饲养细胞的制备，包括以下步骤：

(A)取BALB/c小鼠，拉颈处死小鼠浸泡于75％乙醇1min；

(B)将小鼠移入超净工作台内，以仰卧位固定在解剖板上，用眼科剪剪开胸部皮肤，用两手纵向拉开皮肤，暴露腹部，并用酒精棉球擦拭腹膜消毒；

(C)用注射器抽取5ml不完全培养液注入腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1～2min，随后吸出细胞悬液，移入离心管中；

(D)加不全1640培养液5ml，1500rpm离心5min，弃上清；用5ml HAT培养液将沉淀细胞重悬，根据细胞计数结果，补加HAT培养液，使细胞浓度为2×10⁵个/ml，一般每只小鼠得2～5×10⁶个巨噬细胞；

(E)将步骤(D)得到的细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml，然后置37℃5％CO₂及饱和湿度条件下培养，次日供融合实验用。

进一步，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合方法为：

(一)、将配好的50％PEG4000置于37℃孵箱中预温；

(二)、将1×10⁸脾细胞与2×10⁷～5×10⁷骨髓瘤细胞SP2/0在50ml尖底离心管中混匀，补加不完全培养液至30ml；

(三)、1500rpm离心5min，弃上清液；

(四)、用食指轻弹离心管底部，使细胞沉淀团块稍松散；置40℃水浴中预热；

(五)、一手均匀转动离心管，另一手用1ml吸管边滴边轻轻搅动，同时在1min内加50％PEG4000 0.7ml；

(六)、第2min：继续搅拌；第3min：加入1mlRPMI 1640培养液；第4min：加入3mlRPMI 1640培养液；第5min：加总液体量至30ml；

(七)、800rpm离心5min，弃去上清；

(八)、加入20ml HAT培养液，重悬沉淀细胞；

(九)、接种于含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml；然后将培养板置37℃，5％CO₂及饱和湿度下培养；

(十)、融合后7d～10d内用HAT培养液行半量换液；

(十一)、2W后用HT培养液换出HAT培养液；3W后换完全1640培养液；

(十二)、培养8d～12d，克隆可长至孔底面积的1/3～1/2，此时可取培养上清液，进行抗体检测。

进一步，用间接ELISA法检测细胞培养上清方法，包括以下步骤：

一)、PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-BSA、CoIα12-BSA、Trx11-BSA分别溶于pH9.6的碳酸盐缓冲液，浓度20μg/ml，100μl/孔,4℃过夜；

二)、弃孔内液体，PBST洗3次，拍干；

三)、每孔加200μl封闭液，4℃过夜；

四)、弃孔内液体，PBST洗3次，拍干；

五)、每孔加100μl待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育2小时；

六)、弃孔内液体，PBST洗3次，拍干；

七)、每孔加HRP标记的鼠抗人IgG100μl，37℃孵育30min；弃孔内液体，PBST洗8次，拍干；

八)、每孔加TMB 50μl，H₂O₂ 50μl，室温避光孵育30min；

九)、每孔加2mol/L H₂SO₄，终止反应；

十)判定结果：若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔呈黄色，试验孔的颜色与阳性孔的颜色基本一样，可判定为阳性；酶标仪测定各孔OD_450nm值，以P/N≥2.1，或P≥N+3SD为阳性。

进一步，克隆方法包括以下步骤：

A、取正常小鼠腹腔巨噬细胞，制成细胞悬液，接种96孔培养板，每孔0.1ml，含2×10⁴个巨噬细胞；

B、用弯吸管吹打杂交瘤细胞培养板中孔内的克隆，悬浮于完全1640培养液中；

C、取样，用血球计数板计数，调整细胞密度至100、50、10个/ml；

D、分别将三种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞的培养板中，每孔加0.1ml，理论上每孔分别含10、5、1个细胞；

E、在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养，10d后半量换液，培养10～14d后取培养上清液进行抗体检测；

F、对阳性单克隆再克隆化培养，直到100％的克隆分泌特异性抗体为止；

G、将阳性克隆进一步扩大培养，冻存。

进一步，细胞的冻存方法包括以下步骤：

a、将细胞培养瓶内的细胞吹打下来后，移入离心管中；

b、1500rpm离心10min，弃上清；

c、加入细胞冻存液，使细胞密度为10⁶～10⁷个/ml；

d、分装细胞于细胞冻存管，1ml/管，标明细胞名称、冻存日期；

e、将细胞冻存管放入一带收口绳的小布袋内，布袋上表明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱；

f、2小时～4小时后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。

本发明用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-KLH、CoIα12-KLH、Trx11-KLH通过脾内包埋免疫BALB/c小鼠取得了较好的免疫应答；应用杂交瘤细胞技术，常规细胞融合，用ELISA法进行抗体筛选，选择阳性较强的杂交瘤细胞孔内的杂交瘤细胞进行了克隆；

获得三株针对PGAM的杂交瘤细胞株，两株针对CoIα的杂交瘤细胞株，五株针对Trx的杂交瘤细胞株，三株针对PGAM13的杂交瘤细胞株，四株针对CoIα12的杂交瘤细胞株，三株针对Trx11的杂交瘤细胞株。

本发明分别获得了3、2、5、3、4、3株抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11的单克隆抗体，抗体同型均为IgM。

本发明解决了现有技术抗体不具有高亲和力、不具有高特异性、毒副作用大，现有技术制备方法中获得的重组抗体浓度偏低，成本高，不适合工业上的大规模生产应用的问题。

附图说明

图1是本发明实施例提供的单克隆抗体的制备方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明实施例提供的单克隆抗体，包括抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11；

所述抗PGAM的核苷酸序列为SEQ ID NO1为：

所述CoIα的核苷酸序列为SEQ ID NO2为：

所述Trx的核苷酸序列为SEQ ID NO3为：

所述PGAM13的核苷酸序列为SEQ ID NO4为：

CSAQGVTEAEQAG。

所述CoIα12的核苷酸序列为SEQ ID NO5为：

CLRMRYKRSAVV。

所述Trx11的核苷酸序列为SEQ ID NO6为：

CEF KVNKSETI。

如图1所示：本发明实施例提供的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

S101：通过脾内包埋用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11免疫小鼠；

S102：取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合；

S103：用间接ELISA法检测细胞培养上清。

下面结合试验及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1主要材料与试剂

(1)PGAM13(CSAQGVTEAEQAG)、CoIα12(CLRMRYKRSAVV)、Trx11(CEF KVNKSETI)多肽由invitrogen公司合成，并分别偶联载体蛋白KLH、BSA；

(2)BALB/c小鼠，雌性，体重18～22g，鼠龄6～8周，购自上海斯莱克实验动物中心，饲以标准食料；

(3)SP2/0小鼠骨髓瘤细胞株为本室保存；

(4)1640培养粉购自sigma公司；

(5)H(次黄嘌呤)、A(氨基喋呤)、T(胸腺嘧啶核苷)购自sigma公司；

(6)细胞培养板购自costar公司；

(7)新生牛血清购自Gibco公司；

(8)降植烷购自sigma公司；

(9)HRP标记的鼠人IgG购自invitrogen公司；

(10)PEG4000购自Merck公司；

(11)抗体亚类分型试剂盒购自sigma公司；

(12)DMSO购自sigma公司；

(13)福氏不完全佐剂购自sigma公司；

(14)其余试剂均为市售分析纯。

1.1.2主要仪器

1.1.3主要试剂

(1)不完全RPMI-1640培养基：

(2)完全RPMI-1640培养基：不完全RPMI-1640培养基80ml，小牛血清15～20ml。

(3)HT培养基：完全RPMI-1640培养基99ml，HT贮存液1ml。

(4)HAT培养基：完全RPMI-1640培养基98ml，HT贮存液1ml，A贮存液1ml。

(5)A贮存液(×100，4×10^-5mol/L)：称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin,MW 440.4)，溶于90ml超纯水中，滴加1mol/L HCl 0.5ml中和，再补加超纯水至100ml。过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，-20℃保存。

(6)HT贮存液(×100,H：10^-2mol/L，T：1.6×10^-3mol/L)：称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超纯水至100ml，置45～50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，-20℃冻存。

(7)L-谷氨酰氨(L-glutamine，L.G.)溶液(×100，0.2mol/L)称取2.92g L-谷氨酰氨(MW 146.15)，用100ml超纯水溶解，过滤除菌，分装小瓶(4ml/瓶)，-20℃冻存。

(8)青、链霉素(双抗)溶液(100×)：取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g，溶于100ml灭菌超纯水中，分装小瓶(4ml/瓶)，-20℃冻存。

(9)7.5％NaHCO₃溶液：称取NaHCO₃ 7.5g，溶于100ml超纯水中，过滤除菌，分装小瓶(4ml/瓶)，盖紧瓶塞，4℃保存。

(10)HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW 238.3)溶液(1mol/L)：称取23.83g HEPES溶于100ml超纯水中，过滤除菌，分装小瓶(4ml/瓶)，4℃保存。

(11)50％PEG：称取PEG4000 2g放入青霉素小瓶，加胶塞并插一针头，356.18kPa高压蒸汽15min，即刻加入2ml完全培养液(其中含0.3ml二甲基亚砜)。

(12)碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na₂CO₃ 8ml，0.2mol/L NaHCO₃ 17ml混合，再加75ml蒸馏水，调pH至9.6。

(13)Tris-HCl缓冲液(pH8.0，0.02mol/L)：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，补加蒸馏水至1000ml。

(14)洗涤缓冲液(PH7.4的PBST)：

(15)封闭液：牛血清白蛋白(BSA)0.1g，加洗涤液至100ml。

(16)酶反应终止液(2mol/L H₂SO₄)：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸

(98％)21.7ml。

(17)底物缓冲液(pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液)：

0.2mol/L Na₂HPO₄ 25.7ml

0.1ml/L柠檬酸 24.3ml

蒸馏水 50ml

(18)底物使用液：TMB底物使用液：TMB(1mg/ml)1.0ml，底物缓冲液10ml。

(19)秋水仙素溶液： 秋水仙素 10mg

生理盐水 100ml

过滤除菌，-20℃保存。

(20)固定液：3份甲醇加1份冰醋酸，临用前配制。

(21)1：10Giemsa染色液：1份Giemsa原液加9份1/15mol/L,pH6.8磷酸盐缓冲液。

1.2方法

1.2.1小鼠免疫

(1)将高压灭菌过的滤纸片剪成1mm×3mm大小纸条，浸入免疫原(PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-KLH、CoIα12-KLH、Trx11-KLH)液体中；

(2)用小鼠板固定小鼠，眼眶采血后打开腹腔；

(3)游离脾脏，将滤纸条植入脾脏内；

(4)关腹，缝合，创可贴包扎切口；

(5)将小鼠松开，标记免疫时间、免疫原名称、操作者，单独放入小鼠笼内饲养；

(6)一周后腹部皮下加强免疫一次。

1.2.2SP2/0细胞的准备

(1)取1管冻存的SP2/0细胞，置于37℃水浴1min，用滴管移入10ml离心管内加入5ml不全1640培养液，1500rpm离心5min，弃上清；

(2)加入5ml完全1640培养液，重悬细胞，移入细胞培养瓶，置37℃二氧化碳培养箱培养；

(3)于融合前48～36小时，将骨髓瘤细胞扩大培养；

(4)融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管内；

(5)1500rpm离心5min，弃去上清；

(6)加入30ml不完全培养液，1500rpm离心5min，弃去上清；

(7)加入10ml不完全培养液重悬细胞；

(8)取细胞悬液行细胞计数。细胞计数时，取细胞悬液0.1ml加入0.9ml不全1640培养液中，混匀，用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数＝4个大方格细胞数×10⁵/4；或每毫升细胞数＝5个中方格细胞数×10⁶/2。

1.2.3制备免疫脾细胞悬液

(1)取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清；

(2)通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养液的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织；

(3)将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养液的平皿中，用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏)，使脾细胞进入平皿中的不完全培养液。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。用200目铜网过滤。

(4)收获脾细胞悬液，1500rpm离心5min，用不完全培养液离心洗涤3次，然后将细胞重悬于10ml不完全培养液；

(5)取上述悬液，行细胞计数后备用。通常每只小鼠可获得1×10⁸～2.5×10⁸个脾细胞。

1.2.4饲养细胞的制备

(1)取BALB/c小鼠，拉颈处死小鼠浸泡于75％乙醇1min；

(2)将小鼠移入超净工作台内，以仰卧位固定在解剖板上，用眼科剪剪开胸部皮肤，用两手纵向拉开皮肤，暴露腹部，并用酒精棉球擦拭腹膜消毒；

(3)用注射器抽取5ml不完全培养液注入腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1～2min，随后吸出细胞悬液，移入离心管中；

(4)加不全1640培养液5ml，1500rpm离心5min，弃上清。用5ml HAT培养液将沉淀细胞重悬，根据细胞计数结果，补加HAT培养液，使细胞浓度为2×10⁵个/ml，一般每只小鼠可得2～5×10⁶个巨噬细胞；

(5)将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1ml，然后置37℃5％CO₂及饱和湿度条件下培养，次日可供融合实验用。

1.2.5细胞融合

(1)将配好的50％PEG4000置于37℃孵箱中预温；

(2)将1×10⁸脾细胞与2×10⁷～5×10⁷骨髓瘤细胞SP2/0在50ml尖底离心管中混匀，补加不完全培养液至30ml；

(3)1500rpm离心5min，弃上清液；

(4)用食指轻弹离心管底部，使细胞沉淀团块稍松散；置40℃水浴中预热。

(5)一手均匀转动离心管，另一手用1ml吸管边滴边轻轻搅动，同时在1min内加50％PEG4000 0.7ml；

(6)第2min：继续搅拌；第3min：加入1mlRPMI 1640培养液；第4min：加入3mlRPMI 1640培养液；第5min：加总液体量至30ml；

(7)800rpm离心5min，弃去上清；

(8)加入20ml HAT培养液，重悬沉淀细胞；

(9)接种于含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml；然后将培养板置37℃，5％CO₂及饱和湿度下培养。

(10)融合后7～10d内用HAT培养液行半量换液；

(11)2W后用HT培养液换出HAT培养液；3W后换完全1640培养液；

(12)培养8～12d，克隆可长至孔底面积的1/3～1/2，此时可取培养上清液，进行抗体检测。

1.2.6单克隆抗体的检测(ELISA法)

(1)PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-BSA、CoIα12-BSA、Trx11-BSA分别溶于pH9.6的碳酸盐缓冲液，浓度20μg/ml，100μl/孔,4℃过夜；

(2)弃孔内液体，PBST洗3次，拍干；

(3)每孔加200μl封闭液，4℃过夜；

(4)弃孔内液体，PBST洗3次，拍干；

(5)每孔加100μl待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育2小时；

(6)弃孔内液体，PBST洗3次，拍干；

(7)每孔加HRP标记的鼠抗人IgG100μl，37℃孵育30min；

(8)弃孔内液体，PBST洗8次，拍干；

(9)每孔加TMB 50μl，H₂O₂ 50μl，室温避光孵育30min；

(10)每孔加2mol/L H₂SO₄，终止反应；

(11)判定结果：若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔呈黄色，试验孔的颜色与阳性孔的颜色基本一样，可判定为阳性。酶标仪测定各孔OD_450nm值，以P/N≥2.1，或P≥N+3SD为阳性。

1.2.7亚克隆(有限稀释法)

(1)取正常小鼠腹腔巨噬细胞，制成细胞悬液，接种96孔培养板，每孔0.1ml，含2×10⁴个巨噬细胞；

(2)用弯吸管吹打杂交瘤细胞培养板中孔内的克隆，悬浮于完全1640培养液中；

(3)取样，用血球计数板计数，调整细胞密度至100、50、10个/ml；

(4)分别将三种密度的杂交瘤细胞悬液接种于含饲养细胞的培养板中，每孔加0.1ml，理论上每孔分别含10、5、1个细胞；

(5)在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养，10d后半量换液，培养10～14d后取培养上清液进行抗体检测；

(6)对阳性单克隆再克隆化培养，直到100％的克隆分泌特异性抗体为止；

(7)将阳性克隆进一步扩大培养，冻存。

1.2.8细胞的冻存

(1)将细胞培养瓶内的细胞吹打下来后，移入离心管中；

(2)1500rpm离心10min，弃上清；

(3)加入细胞冻存液，使细胞密度为10⁶～10⁷个/ml；

(4)分装细胞于细胞冻存管，1ml/管，标明细胞名称、冻存日期；

(5)将细胞冻存管放入一带收口绳的小布袋内，布袋上表明冻存号、细胞名称等，立即将布袋放入吸管筒内，置-70℃冰箱；

(6)2-4小时后从-70℃冰箱取出吸管筒，将盛有细胞布袋移入液氮罐；在布袋的线绳上作好标记或代码；最后在液氮冻存簿上作详细记录。

1.2.9冻存细胞的复苏(见1.2.2)

1.2.10单克隆抗体的大量制备(腹水法)

(1)取BALB/c小鼠，腹腔注射降植烷0.5ml+福氏不完全佐剂0.5ml；

(2)收集生长良好的杂交瘤细胞，离心洗涤1次，重悬于无血清培养液中，调整细胞密度为(1～2)×10⁶个/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml细胞悬液；

(3)接种细胞7～12d，可见小鼠腹部明显膨大。消毒腹部皮肤，用5ml注射器接8号针头，刺入腹腔，卸下注射器，太高小鼠头部，使腹水滴入离心管中；

(4)3000rpm离心15min，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，分装，-70℃保存备用。

1.2.11腹水纯化(高速离心加二氧化硅吸附法)

(1)取腹水适量，10000rpm 15min；

(2)取上层清亮的腹水，等量加入pH7.2巴比妥缓冲盐水(VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg²⁺，0.3mmol/L Ca²⁺)稀释；

(3)每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30min，不时摇动；

(4)3000rpm离心20min。

1.2.12染色体分析(秋水仙素法)

(1)取对数生长期细胞，用含10％新生牛血清的完全1640培养液配成细胞悬液，接种于25ml培养瓶中，移入CO₂孵箱培养54h；

(2)终止培养前4～6h，将秋水仙素加入培养液中(终浓度0.04～0.8μg/ml)，继续培养4～6h；

(3)用吸管轻轻吹打分裂相细胞，移入10ml离心管中；

(4)1000rpm离心10min，弃上清液；

(5)逐滴加入0.5ml预温37℃的0.075mol/L KCl混匀，随即补加至5～10ml，用吸管轻轻吹打均匀，37℃孵育20～30min；

(6)向离心管中加入1ml新鲜固定液；

(7)1000rpm离心10min，弃上清液；

(8)沿离心管管壁缓缓加入新鲜固定液8～10ml，用吸管吹打均匀，固定15min；

(9)1000rpm离心10min，弃上清液；

(10)缓缓加入新鲜固定液，用吸管吹打均匀，固定30min；

(11)1000rpm离心10min，弃上清液；视细胞量再加入0.5～1ml新鲜固定液，吹打均匀；

(12)取0℃冰冻的载玻片，距离玻片15cm高度，向玻片滴1～2滴细胞悬液，空气中干燥；

(13)用新鲜Giemsa染色液染15min，流水冲洗玻片背面，晾干；

(14)镜下观察染色体形态，数量。

1.2.13单克隆抗体亚型鉴定

应用IsoStrip单抗亚型鉴定试条，将杂交瘤细胞培养上清1:50稀释，从中取出150μl加入试管，然后再加等量的新鲜稀释液入试管，室温孵育30s后快速摇匀；将单抗亚型鉴定试条插入试管中，黑端向下，5～10min后观察蓝色条带的位置。

2结果

2.1抗原的制备

PGAM、CoIα、Trx蛋白研究三中已经原核表达成功。

2.2杂交瘤细胞的染色体分析

用秋水仙素阻抑法对杂交瘤细胞株的核型分别进行了分析，细胞的染色体数分别为105、109、108、108、110、106，均约为小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞染色体数(分别为42和70)之和，证明确为两亲本细胞融合后的杂交体。

2.3杂交瘤细胞株的建立

用PGAM、CoIα、Trx、PGAM13-KLH、CoIα12-KLH、Trx11-KLH通过脾内包埋免疫BALB/c小鼠取得了较好的免疫应答。应用杂交瘤细胞技术，常规细胞融合，用ELISA法进行抗体筛选，选择阳性较强的杂交瘤细胞孔内的杂交瘤细胞进行亚克隆。

获得了3株针对PGAM的杂交瘤细胞株，2株针对CoIα的杂交瘤细胞株，5株针对Trx的杂交瘤细胞株，3株针对PGAM13的杂交瘤细胞株，4株针对CoIα12的杂交瘤细胞株，3株针对Trx11的杂交瘤细胞株，分别选择其中阳性反应最强的1株进行下一步实验，序号分别为：4G5、4F4、5A2、5C3、4H7、5B2，分别命名为：NP61、NP62、NP63、NP71、NP72、NP73；其克隆化结果见表1～6。余者冻存。在半年内对获得的细胞株进行反复冻融，其分泌抗体的稳定性和能力均无改变。

表1 杂交瘤细胞株PGAM4G5克隆化结果

表2 杂交瘤细胞株CoIα4F4克隆化结果

表3 杂交瘤细胞株Trx5A2克隆化结果

表4 杂交瘤细胞株PGAM13 5C3克隆化结果

表5 杂交瘤细胞株CoIα12 4H7克隆化结果

表6 杂交瘤细胞株Trx11 5B2克隆化结果

2.4单克隆抗体的Ig类、亚类鉴定

IsoStrip单抗亚型鉴定试条检测结果显示：抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11的单克隆抗体均属于IgM。

2.5腹水抗体效价的测定

上述单克隆抗体分别经腹腔诱导法制备高滴度特异性的单抗腹水。用间接非竞争性ELISA检测方法测定腹水抗体稀释度：抗PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11腹水单克隆抗体的稀释度分别为：1：6.0×10⁶、1：2.0×10⁶、1：8.0×10⁶、1：3.0×10⁶、1：9.0×10⁵、1：6.0×10⁶；参考工作浓度分别为：1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵、1：6.0×10⁵。

2.6标准曲线

PGAM、CoIα、Trx、PGAM13、CoIα12、Trx11的最低检出限均为5μg/L，线性范围50～500μg/L，线性方程Y＝-0.582X+1.793(r＝0.99，P＜0.05)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 申请人名称:滨州医学院

<120>一种单克隆抗体及其制备方法

<160> 6

<210>1

<211> 753

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

ATGGCTCCCT ACAAAATTGT ATTCATTCGT CATGGGGAGA GTGTTTACAA TGAAGAAAAT

AGATTCTGTG GTTGGCATGA TGCAGACCTT TCAGCGCAAG GTGTCACCGA AGCTGAACAA

GCTGGTCAAT TACTCCACCA AAATCAGTTC ACATTTGACA CTGCCTATAC AAGTGTTCTA

AAAAGAGCTA TTAAAACGTT AAACTTTGTT TTAGACAAAC TCGATCTTAA CTGGATACCT

GTAACGAAAA CGTGGCGTCT AAATGAAAGA ATGTACGGTG CTCTCCAGGG ACTTAATAAG

TCTGAAACTG CTGCTAAACA TGGTGAGCAA CAAGTTAAGA TATGGAGACG TGCATATGAT

ATACCTCCTC CTCCTGTTGA TATTTCGGAC CCTCGCTTCC CTGGTAATGA AGCTAAGTAT

GCTTTACTTG ACTCTTCTTG CATACCACGT ACTGAATGCT TAAAGGACAC TGTACAACGT

GTACTACCAT TCTGGTTTGA TACTATTTCT GCTGATATTA AGAGCTGCAA ACGTGTTCTT

ATTGTCGCTC ACGGTAACAG TTTACGAGCG CTCATTAAGT ACTTGGATAA TACATCTGAT

TCGGATATAG TGGAGCTTAA TATACCTACT GGTATTCCAC TCGTTTATGA ACTAGATGCA

AACCTAAGGC CAATCAAACA CTATTATCTT GCGGATGAAG CAACAGTTGC AGCTGCTATA

GATCGTGTAG CGAATCAAGG AAAGAAGAAA TAA

<210>2

<211> 1317

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

ATGCAAGCGC CGCACAGGTT GTTAATAATG TTGGCTTTAC GTCTTCAAGT TCGAAGATCT

CTGACTAGGA ATATTTCAGG ATGGTCAGAT AATTTGCGTA AGCAATCGAA ACTTTCTGAA

GTTGTTTATT CACGCGAAGA TAAATATGGA GCACACAATT ACCACCCTCT ACCAGTAGCA

TTATCAAAAG GCAAAGGAAT TTATGTGTGG GATGTTGAGG GAAACTGTTA TATGGATTTC

TTGAGCGCTT ATAGTGCTGT TAACCAAGGG CACTGTCATC CACGTATTGT TGATGCAATT

AAAACCCAAT CGGAAACACT AACCCTTACT TCACGAGCAT TCTATAATGT TGTTTTGGGA

GAATTTGAGG AAATGGCTAC AAAAATGTTT GGTTATGACA AGGTGTTACC CATGAATTCA

GGTGTTGAAG CTGGTGAAAC CTCTCTAAAA CTTGCACGTA AATGGGGTTA TAAGGTAAAG

AAAATTCCTG ATGGACAAGC CAGAGTTATA TTTGCTGAAG GAAATTTCTG GGGTCGTACG

TTAGCTGCAT GCTCTTCATC CACTGATCCT GCATGCTACT CAGGATTTGG ACCATTTATG

CCAGGCTTTG TAATTGTCCC TTATGATGAC TTAAATGCTC TTGAAGTTGA ATTAAAAAAT

CCAAATACGT GCGCATTTAT GGTGGAACCA ATTCAAGGTG AAGCTGGCGT TCGTACACCA

TCAGATGGTT ATTTAAAGGG TGTACGAAAA TTGTGTACTA AATATAATGT ACTATTTATT

GCAGATGAAA TACAAACTGG TTTAGGCAGA ACAGGAAAAC GACTTTGTGT AAATCATGAA

GATGTTCGAC CAGACATTGT TTTACTTGGC AAAGCTTTAT CAGGAGGAAT GCTTCCAATC

TCTGCTGTTC TTGCCGATGA TGAAGTAATG CTGACTATTC AACCTGGGGA ACATGGGTCA

ACTTATGGTG GTAATCCATT AGCATGTAGA GTTGCTATGG CCGCTTTACG TGTTTTAGAA

GAGGAAGGTT TAGCAGAACG TGCACAGAAA TTGGGTGAAA TCTTCCGCAA TGAATTGAGT

AAACTCCCAA AATCTGTAGT TGAATTATAT CGTGGCAAAG GGCTTTTAAA CGCTATTGTA

ATTCGTCAAG GATTCAATGC ATGGGATGTT TGTTTAAAGT TACGCGATCA TGGTTTATTG

GCTAAGCCTA CACACGACAC AATAATTCGA TTAGCCCCAC CTTTAGTTAT TAAAGAAGAT

GAGTTGCATA AAGCGGCAGA GATTATGCAC AAAGTGATTG GTTCGTTGAG TAATTAG

<210>3

<211>261

<212> RNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

ATGAGTAACG TACTGCATAT AGAAACCGAT GACGATTTTG ATTCTTTCTT AAAGGAAAAT

AAGGATAAAT TAATTGTTGT TGATTTTTTC GCAACTTGGT GTGGGCCGTG TAAAAAAATA

GCTCCTGCTT TCGAAGCGTT GAGCGCTGAT CGTTCGGCAT TATATGTGAA GGTTGACGTG

GATAAACTTG AAGAAACTGC CAAAAGATAC GATGTAACAG CTATGCCGAC GTTTGTTGTG

ATAAAAAATG GCGAAAAAGT CGATACAGTG GTTGGAGCTT CTATAGAAAA TGTTGAAGCT

GTGATCCGGA AACACAAATG A

<210>4

<211>13

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

CSAQGVTEAEQAG；

<210>5

<211>12

<212> RNA

<213>人工序列

<400> 核苷酸序列

CLRMRYKRSAVV；

<210>6

<211> 11

<212> RNA

<213>人工序列

<400>核苷酸序列

CEF KVNKSETI。