一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用的制造方法与工艺

文档序号:11124297
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及肿瘤抑制蛋白变体。

背景技术:
KIAA0157定位于10q26.13(NM_032182.),mRNA全长3008bp,cDNA1248bp,编码416个氨基酸(序列2),分子量为47KD的蛋白质。小鼠、大鼠与人的KIAA0157同源性高达90%以上,说明它在进化过程中高度保守,可能发挥着重要的生物学功能。利用生物信息学分析显示,KIAA0157蛋白内部215-266位氨基酸处存在着一个coiledcoil结构域,此结构域通常存在于单体蛋白质中,且高度保守,通常介导蛋白与蛋白之间的相互作用。在对抗凋亡蛋白BPE(BRCA复合体亚基4)的相互作用蛋白筛选过程中,KIAA0157被筛选到。该基因及蛋白为全细胞分布,并在多种肿瘤组织中明显下调表达。高表达KIAA0157可抑制包括肝癌细胞\肺癌细胞\神经母细胞瘤细胞的生长,并导致细胞发生G0/G1期阻滞。在现有技术中,为了提高蛋白的活性,针对蛋白的活性位点进行特异性的突变和取代,从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性,申请人通过大量的实验,针对KIAA0157氨基酸序列中特定的位点进行了点突变,从而获得了比KIAA0157蛋白本身具有更高抑制活性的变体。发明详述本发明涉及亲本蛋白的分离的变体,其在至少一个对应于SEQIDNO:1的成熟多肽的位置I40H、H57Q、K85P、W94Q、Q110S、H113G、H141Y、N151A、S159P、L160P、K190I、Y213I、V220F、A222Y、R232P、V241Q、R260P、S267T、D276E、S286L、D298S、D303L、Y308K、P313K、Q316S、T319H、H322S、S328A、M331Q、R333R、G338A、P359I、G366F、S372I和P383L的位置包含修饰。具体而言,本发明的变体具有改善的抑制活性。优选地,应用于本发明的方法、呈现改善的热稳定性和抑制活性的蛋白变体包含至少2种任一下述修饰:I40H/A222Y、H57Q/V220F、K85P/H322S、W94Q/S328A、Q110S/H113G、H141Y/P383L、N151A/G366F、L160P/P383L、K190I/D298S、K85P/R232P、V241Q/S286L、H57Q/R260P、S286L/P383L、W94Q/D298S、Y213I/D303L、Q316S/S372I、Q110S/G338A。本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法,包括(a)培养宿主细胞;和(b)回收所述蛋白变体。在本发明的产生方法中,使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如,可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养,和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中,该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌,其能够从细胞裂解物(lysate)回收。所得多...
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