一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用的制作方法

文档序号:11124297

本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及肿瘤抑制蛋白变体。



背景技术:

KIAA0157定位于10q26.13(NM_032182.),mRNA全长3008bp,cDNA1248bp,编码416个氨基酸(序列2),分子量为47KD的蛋白质。小鼠、大鼠与人的KIAA0157同源性高达90%以上,说明它在进化过程中高度保守,可能发挥着重要的生物学功能。利用生物信息学分析显示,KIAA0157蛋白内部215-266位氨基酸处存在着一个coiled coil结构域,此结构域通常存在于单体蛋白质中,且高度保守,通常介导蛋白与蛋白之间的相互作用。在对抗凋亡蛋白BPE(BRCA复合体亚基4)的相互作用蛋白筛选过程中,KIAA0157被筛选到。该基因及蛋白为全细胞分布,并在多种肿瘤组织中明显下调表达。高表达KIAA0157可抑制包括肝癌细胞\肺癌细胞\神经母细胞瘤细胞的生长,并导致细胞发生G0/G1期阻滞。

在现有技术中,为了提高蛋白的活性,针对蛋白的活性位点进行特异性的突变和取代,从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性,申请人通过大量的实验,针对KIAA0157氨基酸序列中特定的位点进行了点突变,从而获得了比KIAA0157蛋白本身具有更高抑制活性的变体。

发明详述

本发明涉及亲本蛋白的分离的变体,其在至少一个对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置I40H、H57Q、K85P、W94Q、Q110S、H113G、H141Y、N151A、S159P、L160P、K190I、Y213I、V220F、A222Y、R232P、V241Q、R260P、S267T、D276E、S286L、D298S、D303L、Y308K、P313K、Q316S、T319H、H322S、S328A、M331Q、R333R、G338A、P359I、G366F、S372I和P383L的位置包含修饰。具体而言,本发明的变体具有改善的抑制活性。

优选地,应用于本发明的方法、呈现改善的热稳定性和抑制活性的蛋白变体包含至少2种任一下述修饰:I40H/A222Y、H57Q/V220F、K85P/H322S、W94Q/S328A、Q110S/H113G、H141Y/P383L、N151A/G366F、L160P/P383L、K190I/D298S、K85P/R232P、V241Q/S286L、H57Q/R260P、S286L/P383L、W94Q/D298S、Y213I/D303L、Q316S/S372I、Q110S/G338A。

本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法,包括(a)培养宿主细胞;和(b)回收所述蛋白变体。

在本发明的产生方法中,使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如,可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养,和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中,该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌,其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如,多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收,所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化,所述方法包括但不限于层析(例如,离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如,制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见,例如,Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。

本发明的多肽用于制备相应的药物,用于治疗癌症,优选的,治疗肝癌。

具体实施方式

实施例1:KIAA0157基因的获得

提出人骨髓细胞总RNA,按反转录试剂盒(Promega公司)说明书进行反转录。取1μg定量后的RNA,加水补至10.5μl,70℃、10min,加入2μl的10×buffer、2μl的MgCl2、2μl的dNTP、1μl的oligo dT、1μl的rRNasin、1.5μl的AMV(15U),反应体系共20μl;42℃、1h;94℃、5min;4℃、5min。RNA即反转录为cDNA。以5’-CGGAATTCAATGTCCTACAG AGAGCAGGTT-3’;5’-GGGGATCCTTAAATCTGGGAGG TCTGAGTG-3’为引物PCR扩增目的片段。PCR条件为:

Cycle 1(1x)

94℃5min

Cycle 2(30x)

94℃1min

55℃30s

72℃1min

Cycle 3(1x)

72℃10min

PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果产生特异的DNA条带,将该DNA片段与PMD-18-T载体(TAKARA生物公司)连接,连接产物转化E.coli JM109,菌落PCR鉴定为阳性克隆后,再经酶切鉴定后测序。测序后的序列为序列1所示。

实施例2:相应突变后的KIAA0157的获得方法

1.突变点的引入

(1)根据相应的突变位点设计相应的诱变引物,采用PCR定点突变法在KIAA0157基因上把野生型对应的氨基酸位点进行突变;

(2)上述PCR产物经胶回收纯化后,用限制性内切酶进行酶切,与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接后,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;

2.鉴定重组质粒:用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定,并测序检验,由此得到突变后的核苷酸序列。

实施例3、KIAA0157变体过表达抑制细胞集落形成

为了研究KIAA0157变体对细胞增殖有影响,我们构建了KIAA0157变体-myc/hisB+真核表达载体,并采用集落形成实验检测了KIAA0157变体在HepG2细胞中过表达后其增殖的变化情况。结果如下:

表1KIAA0157变体过表达抑制细胞集落形成情况

实施例4KIAA0157变体表达引起HepG2细胞G0/G1期阻滞

为了解KIAA0157变体对HepG2细胞周期的影响,我们在HepG2细胞转染了带GFP标签的KIAA0157的真核表达载体,流式细胞仪检测细胞周期各时相的分布。通过实验发现,与转染KIAA0157原始蛋白相比,转染KIAA0157变体的真核表达载体后HepG2细胞出现G0/G1期阻滞的变化,结果如下:

表2KIAA0157变体针对HepG2细胞G0/G1期阻滞的影响水平

序列表

<110>朱育盼

〈120〉一种人肿瘤抑制蛋白变体及其应用

〈160〉1

〈210〉1

〈211〉416

〈212〉PRT

〈213〉人种(Homo Sapiens.)

〈400〉1

Met Ala Ala Ser Ile Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ala Val Cys Phe His 16

Ser Ala Asn Ser Asn Ala Asp His Glu Gly Phe Leu Leu Gly Glu Val 32

Arg Gln Glu Glu Thr Phe Ser Ile Ser Asp Ser Gln Ile Ser Asn Thr 48

Glu Phe Leu Gln Val Ile Glu Ile His Asn His Gln Pro Cys Ser Lys 64

Leu Phe Ser Phe Tyr Asp Tyr Ala Ser Lys Val Asn Glu Glu Ser Leu 80

Asp Arg Ile Leu Lys Asp Arg Arg Lys Lys Val Ile Gly Trp Tyr Arg 96

Phe Arg Arg Asn Thr Gln Gln Gln Met Ser Tyr Arg Glu Gln Val Leu 112

His Lys Gln Leu Thr Arg Ile Leu Gly Val Pro Asp Leu Val Phe Leu 128

Leu Phe Ser Phe Ile Ser Thr Ala Asn Asn Ser Thr His Ala Leu Glu 144

Tyr Val Leu Phe Arg Pro Asn Arg Arg Tyr Asn Gln Arg Ile Ser Leu 160

Ala Ile Pro Asn Leu Gly Asn Thr Ser Gln Gln Glu Tyr Lys Val Ser 176

Ser Val Pro Asn Thr Ser Gln Ser Tyr Ala Lys Val Ile Lys Glu His 192

Gly Thr Asp Phe Phe Asp Lys Asp Gly Val Met Lys Asp Ile Arg Ala 208

Ile Tyr Gln Val Tyr Asn Ala Leu Gln Glu Lys Val Gln Ala Val Cys 224

Ala Asp Val Glu Lys Ser Glu Arg Val Val Glu Ser Cys Gln Ala Glu 240

Val Asn Lys Leu Arg Arg Gln Ile Thr Gln Arg Lys Asn Glu Lys Glu 256

Gln Glu Arg Arg Leu Gln Gln Ala Val Leu Ser Arg Gln Met Pro Ser 272

Glu Ser Leu Asp Pro Ala Phe Ser Pro Arg Met Pro Ser Ser Gly Phe 288

Ala Ala Glu Gly Arg Ser Thr Leu Gly Asp Ala Glu Ala Ser Asp Pro 304

Pro Pro Pro Tyr Ser Asp Phe His Pro Asn Asn Gln Glu Ser Thr Leu 320

Ser His Ser Arg Met Glu Arg Ser Val Phe Met Pro Arg Pro Gln Ala 336

Val Gly Ser Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Ser Ala Gly Leu Lys Tyr Pro 352

Gly Ser Gly Ala Asp Leu Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Gly Asp Ser 368

Gly Glu Asp Ser Asp Asp Ser Asp Tyr Glu Asn Leu Ile Asp Pro Thr 384

Glu Pro Ser Asn Ser Glu Tyr Ser His Ser Lys Asp Ser Arg Pro Met 400

Ala His Pro Asp Glu Asp Pro Arg Asn Thr Gln Thr Ser Gln Ile 415

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