培养基及其应用的制作方法

本发明涉及细胞领域，特别涉及培养基及其应用。
背景技术：
：间充质干细胞是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。许多临床应用已经证实，间充质干细胞能解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。许多的研究也证实，间充质干细胞分泌的营养物质也具有与间充质干细胞相似的作用，现在，越来越多的学者相信，间充质干细胞分泌的营养物质或许比细胞本身的作用更加重要。MSCs能分泌包括血管内皮生长因子(vEGF)、胎盘生长因子(PGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)等在内的各种生长因子，这些生长因子可参与多种细胞反应。而稳定可靠的培养条件下收集的条件培养基是取得细胞分泌的营养物质的有效手段。条件培养制备的方法有很多，方法一，如去掉培养用培养基后，条件无血清培养基继续培养后收集条件培养基；方法二，直接收集培养后含血清或血清替代物的条件培养基，含有间充质干细胞的条件培养基的角膜内皮细胞培养用培养基等。但牛血清成分复杂，来源不稳定，使得条件培养基的质量不可控制且存在潜在威胁。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了培养基及其应用。培养基使用DMEMF12+非必需氨基酸，营养更佳丰富，为细胞合成各种活性蛋白提供更丰富广泛的来源，提高了蛋白获得量。使用该培养基培养间充质干细胞收集得到的条件培养基培养间充质干细胞，细胞数量和活性显著提高。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种培养基，包括基础培养基和非必需氨基酸。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基中所述非必需氨基酸选自甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-丝氨酸。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基中所述基础培养基为DMEMF12。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基中所述非必需氨基酸在所述基础培养基中的浓度为0.05～0.2mM。在本发明的一些具体实施方案中，所述培养基中所述培养基的使用剂量为：每2.5×104个细胞使用所述培养基0.1～0.2mL。本发明还提供了所述培养基在培养间充质干细胞中的应用。本发明还提供了所述培养基在培养间充质干细胞收集条件培养基中的应用。本发明还提供了一种间充质干细胞条件培养基的制备方法，取间充质干细胞初步培养后，与本发明提供的所述培养基混合后继续培养，收集培养上清。在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述初步培养为取P1～P5代的间充质干细胞(不限来源，包括脂肪、脐带、牙髓、羊膜等)，使用DMEMF12+10％FBS+0.05～0.1mMNEAA培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到70～90％，去培养上清，用PBS洗涤。本发明还提供了所述制备方法制得的间充质干细胞条件培养基。本发明提供了一种培养基，包括基础培养基和非必需氨基酸。该培养基使用DMEMF12+非必需氨基酸，营养更佳丰富，为细胞合成各种活性蛋白提供更丰富广泛的来源，提高了蛋白获得量。使用该培养基培养间充质干细胞收集得到的条件培养基培养间充质干细胞，细胞数量和活性显著提高。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示细胞增殖情况。具体实施方式本发明公开了培养基及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。1、取P1～P5代的间充质干细胞(不限来源，包括脂肪、脐带、牙髓、羊膜等)，使用DMEMF12+10％FBS+0.05～0.1mMNEAA培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到70～90％，去培养上清，用PBS洗两遍后，加入0.1～0.2ml/cm2(cm2为培养皿或培养板的底面积，约2.5×104个细胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA静置培养24h后，收集条件培养基；再加入0.1～0.2ml/cm2(cm2为培养皿或培养板的底面积，约2.5×104个细胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA继续培养24h后，收集条件培养基；再加入0.1～0.2ml/cm2(cm2为培养皿或培养板的底面积，约2.5×104个细胞)的DMEMF12+0.05～0.2mMNEAA继续培养24h后，收集最后一次条件培养基。把三天收集的条件培养合并。第一次为细胞培养基，是为了细胞增殖；后续三次是无血清的的细胞培养基，是为了收集条件培养基。2、收集到的条件培养基200～400g离心5～10min，取上清，过0.22μm滤膜。3、3KD滤膜包超滤浓缩至1/5到1/20原体积，所得即为制备所得的条件培养基。本发明提供了一种培养基，包括基础培养基和非必需氨基酸。该培养基使用DMEMF12+非必需氨基酸，营养更佳丰富，为细胞合成各种活性蛋白提供更丰富广泛的来源，提高了蛋白获得量。使用该培养基培养间充质干细胞收集得到的条件培养基培养间充质干细胞，细胞数量和活性显著提高。本发明提供的培养基及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。市售的DMEMF12培养基(GIBCO货号：12400-024)；NEAA(GIBCO货号：11140-050)成分如下：(单位mM，浓度均为0.05～0.2mM)；包括Glycine；L-Alanine；L-Asparagine；L-Asparticacid；L-GlutamicAcid；L-Proline；L-Serine。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例11、取P1代的脂肪间充质干细胞(使用DMEMF12+10％FBS+NEAA培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到80％，去培养上清，用PBS洗两遍后；加入0.1ml/cm2的DMEMF12+0.1mMNEAA静置培养24h后，收集条件培养基；再加入0.1ml/cm2DMEMF12+0.1mMNEAA继续培养24h后，收集条件培养基；再加入0.1ml/cm2DMEMF12+0.1mMNEAA继续培养24h后，收集最后一次条件培养基。把三天收集的条件培养合并。2、收集到的条件培养基200g离心5min，取上清，过0.22μm滤膜。3、3KD滤膜包超滤浓缩至1/5原体积，所得即为制备所得的条件培养基。对比例1、取P1代的脂肪间充质干细胞(使用DMEMF12+10％FBS+NEAA培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到80％，去培养上清，用PBS洗两遍后；加入0.1ml/cm2的DMEM静置培养24h后，收集条件培养基；再加入0.1ml/cm2DMEM继续培养24h后，收集条件培养基；再加入0.1ml/cm2DMEM继续培养24h后，收集最后一次条件培养基。把三天收集的条件培养合并。2、收集到的条件培养基200g离心5min，取上清，过0.22μm滤膜。3、3KD滤膜包超滤浓缩至1/5原体积，所得即为制备所得的条件培养基。实施例3使用bradford法检测获得的总蛋白量，结果如表1所示：(单位：μg/ml)表1单位：μg/ml123实施例1115123120对比例766981结果可见，发明组(实施例1制得的条件培养基)获得的蛋白量明显高于对比组(对比例)，P<0.01。使用条件培养基培养P15代的脂肪间充质干细胞，检测其增殖情况：阴性对照：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA对照组：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA+20％对照组(对比例)条件培养基发明组：DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA+20％发明组(实施例1)条件培养基，每组设三个重复，连续培养7天，结果如表2所示：表2由图1、表2可看出，细胞培养至第五天后，进入平台期，细胞增殖缓慢，但发明组在连续7天后，细胞数量明显高于其余两组，即发明组对P15代细胞的促进作用强于对照组及阴性对照组(P<0.05)，证明发明组不但蛋白含量高于对照组，活性也高于对照组。实施例41、取P3代的脐带间充质干细胞，使用DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到70％，去培养上清，用PBS洗两遍后，加入0.2ml/cm2的DMEMF12+0.05mMNEAA静置培养24h后，收集条件培养基；再加入0.2ml/cm2DMEMF12+0.05mMNEAA继续培养24h后，收集条件培养基；再加入0.2ml/cm2DMEMF12+0.05mMNEAA继续培养24h后，收集最后一次条件培养基。把三天收集的条件培养合并。2、收集到的条件培养基400g离心10min，取上清，过0.22μm滤膜。3、3KD滤膜包超滤浓缩至1/20原体积，所得即为制备所得的条件培养基。4、使用bradford法检测获得的总蛋白量，蛋白浓度为：201μg/mL。阴性对照组及对照组同实施例3。取制得的条件培养基按照实施例3的实验方法检测，实验结果与实施例1制得条件培养基的效果相近，两者无显著差异(P＞0.05)。发明组对细胞的促进作用强于对照组及阴性对照组(P<0.05)，证明发明组不但蛋白含量高于对照组，活性也高于对照组。表3实施例51、取P5代的羊膜间充质干细胞，使用DMEMF12+10％FBS+0.1mMNEAA培养，当细胞处于指数生长期，汇合度达到90％，去培养上清，用PBS洗两遍后，加入0.15ml/cm2的DMEMF12+0.2mMNEAA静置培养24h后，收集条件培养基；再加入0.15ml/cm2DMEMF12+0.2mMNEAA继续培养24h后，收集条件培养基；再加入0.15ml/cm2DMEMF12+0.2mMNEAA继续培养24h后，收集最后一次条件培养基。把三天收集的条件培养合并。2、收集到的条件培养基300g离心8min，取上清，过0.22μm滤膜。3、3KD滤膜包超滤浓缩至1/20原体积，所得即为制备所得的条件培养基。4、使用bradford法检测获得的总蛋白量，蛋白浓度为：261μg/mL。阴性对照组及对照组同实施例3。取制得的条件培养基按照实施例3的实验方法检测，实验结果与实施例1制得条件培养基的效果相近，两者无显著差异(P＞0.05)。发明组对细胞的促进作用强于对照组及阴性对照组(P<0.05)，证明发明组不但蛋白含量高于对照组，活性也高于对照组。表4以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3