一种通过固体发酵微生物Clonostachysrogersoniana产生抗生素TMC‑154的方法与流程

本发明涉及微生物代谢产物分离分析领域，具体来说建立了一种通过固态发酵微生物Clonostachys rogersoniana产生抗生素TMC-154的方法。

本发明使用的微生物Clonostachys rogersoniana：[Clonostachys sp 828H2(保藏号：CGMCC No.12073)]保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间：2016年1月15日。

背景技术：

近年来，因微生物具有代谢周期短、转化反应条件温和、副产物少、立体选择性强等特点，通过微生物(真菌、细菌以及藻类)发酵来制备特定化合物的方法越来越受到人们的重视。在实际生产中，已经有大量的应用实例通过微生物发酵来生产一些新颖的、活性较高的以及对人体健康有益的药物。

TMC-154是聚酮苷类化合物，其结构特征在于具有一个独特的高度甲基化的erythromycins类型聚酮母核、一个阿拉伯醇侧链和一个甲基甘露糖取代。文献报道该类化合物对多种肿瘤细胞具有生长抑制活性，且对二酰甘油乙酰转移酶(DGAT)具有抑制活性。在体外细胞毒活性筛选实验中，TMC-154对人体白血病早幼粒细胞株HL-60，人体肝癌细胞株SMMC-7721，人体非小细胞肺癌细胞株A-549，人体乳腺癌细胞株MCF-7及人体结肠癌细胞株SW-480均表现出明显的抑制活性，其半数抑制率(IC₅₀值)分别为2.13μM，15.38μM，17.49μM，15.80μM和14.54μM。而阳性对照顺铂对五株人类肿瘤细胞HL-60，A-549，SMMC-7721，MCF-7和SW-480的IC₅₀值依次为1.72μM，6.82μM，12.19μM，17.40μM和16.35μM。TMC-154对人体乳腺癌细胞株MCF-7和人体结肠癌细胞株SW-480的生长抑制活性强于阳性对照顺铂。因此，TMC-154具有作为先导化合物开发抗肿瘤药物的研究价值。而基于微生物发酵的大量而简单的产生抗生素TMC-154的方法，不仅可以现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础，具有显著的应用价值。

技术实现要素：

本发明旨在通过Clonostachys rogersoniana固体发酵生产抗生素TMC-154。本发明提供了一种转化率高，设备要求低，简便易操作，绿色无污染，适合产业化生产TMC-154的方法。

本发明的目的是通过以下具体技术方案实现的：

(1)将拟用微生物C.rogersoniana 828H2(菌种保藏号CGMCC No.12073)首先进行活化，即将C.rogersoniana 828H2接种到经过120℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4℃冰箱中备用；

(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d；

(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖(以质量百分比计所述发酵培养基成分：25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖)；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；

(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28℃下培养30d后取出；

(5)经微生物C.rogersoniana 828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分离粗提物得到的TMC-154的结构式如下：

(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(10:1—3:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱(甲醇)纯化，通过1D/2D NMR以及HR-ESIMS鉴定得到TMC-154结构；

(7)采用如下HPLC色谱条件测定TMC-154的产量。

①色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)；

②梯度洗脱程序：0–10min，20–40％乙腈；10–20min，40-60％乙腈；20–45min，60％乙腈；

③检测波长：235nm；

④流速：1.0mL/min；

⑤柱温：20℃。

附图说明

图1为本发明中目标化合物的¹H-NMR；

图2为本发明中目标化合物的¹³C-NMR；

图3为本发明中目标化合物的HSQC；

图4为本发明中目标化合物的HMBC；

图5为本发明中目标化合物的HR-ESI-MS。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，但本发明不局限于该具体实施例，本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求范围内的所有可能的备选方案、改进方案和等效方案。

实施例1

(1)将拟用微生物Clonostachys rogersoniana 828H2首先进行活化，即将C.rogersoniana接种到经过120℃高温灭菌处理的PDA斜面培养基后，于恒温培养箱中培养3-7d后，置于4℃冰箱中备用；

(2)将活化的菌种接到PDB种子培养基中，于恒温摇床中培养3-7d；

(3)取洗净的土豆切成丁后，取适量置于组织培养瓶中，加入阿拉伯糖(以质量百分比计所述发酵培养基成分：25g马铃薯，0.5g阿拉伯糖)；将装有培养基的组织培养瓶加盖包装后置于120℃高温灭菌箱中灭菌30min，取出后将组织培养瓶冷却；

(4)将步骤(2)的种子培养基在无菌环境下接种到经过步骤(3)前处理的培养基上，加盖后置于培养箱中28℃下培养30d后取出；

(5)经微生物C.rogersoniana 828H2发酵后的培养基经过甲醇超声提取、过滤和浓缩得到粗提物；分离粗提物得到的TMC-154的结构式如下：

(6)经TLC薄层层析法检测，然后经过硅胶柱进行分离，分离过程采用梯度洗脱，洗脱剂为氯仿：甲醇(10:1—3:1)，然后经分离得到的化合物上凝胶柱(甲醇)纯化，通过1D/2D NMR以及HR-ESIMS鉴定得到TMC-154结构；

(7)采用如下HPLC色谱条件测定TMC-154的产量为3.78g/Kg。

①色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)；

②梯度洗脱程序：0–10min，20–40％乙腈；10–20min，40-60％乙腈；20–45min，60％乙腈；

③检测波长：235nm；

④流速：1.0mL/min；

⑤柱温：20℃。

该方法是一种高效的，具有创新性的，反应条件温和的，绿色无污染的，易扩大化生产的，操作设备简单的大量产生抗生素TMC-154的方法，不仅满足了现代环境保护和低碳经济的需求，而且为后期工业化量产的进一步研究和开发打下了坚实的基础。

实施例2

操作同实施例1，把发酵时间改为35d后，TMC-154的产量为3.76g/Kg。

实施例3

操作同实施例1，把发酵时间改为40d后，TMC-154的产量为3.69g/Kg。