一种鱼类Hepcidin表达促进剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种含特异性免疫激活功能结构域并能高效诱导鱼类产生Hepcidin的人工合成CpG-ODN制剂及其在鱼类先天免疫抗菌中的应用。

(二)

背景技术：

随着我国水产养殖业的迅猛发展，鱼类病害频发并日趋严重，造成巨大经济损失。同时由于抗生素和杀虫剂的大量使用，引起了环境污染、病原耐药和食品安全等问题，严重影响了水产养殖业可持续发展和人们的身体健康。随着国家出台了一系列严格的食品安全标准，一大批抗生素已被禁止应用于水产动物养殖，水产养殖业正面临无药可施的困难局面。因此，亟待研制和开发安全、无公害和环境友好型的新型、高效的鱼类抗病技术和抗病制剂。其中免疫防御技术代表了重要的发展方向。

Hepcidin是一种主要由肝脏表达的生物活性因子，具有抗菌肽和铁离子转运调节素的双重生物学功能。它能通过直接的杀菌作用与间接的降低血清铁浓度而抑制细菌生长的作用，实现有效的免疫抗病，因此是免疫抗病制剂开发应用中最为受到关注的重要因子之一。当前对于Hepcidin的开发应用主要见诸对其基因的克隆与外源性重组表达，而对于通过调控内源性Hepcidin表达而实现免疫抗病的技术尚不多见。外源性重组表达的Hepcidin制剂虽能有效抑制病原菌的侵染，但存在生产成本高、储存和使用过程中易于失活、不利于大规模应用等缺点，特别是由于外源性重组表达的Hepcidin制剂不利于应用在较大规模的水产养殖领域。因此，通过开发内源性Hepcidin高效诱导表达技术而实现免疫抗病是一条重要的替代性途径。

含胞嘧啶鸟嘌呤基序的寡脱氧核糖核酸(CpG-ODN)制剂是一类重要的免疫调节因子。CpG-ODN具有制备成本低、产品稳定、属于核酸制剂无毒副作用、在环境中易于降解而不富集、安全高效和环境友好等优点，因此是极富应用价值的免疫抗病制剂。但CpG-ODN具有种属特异性、组织细胞特异性和特定基因调控的特异性。不同物种中产生免疫学效应的CpG-ODN的序列、组成与结构均不尽相同，同一物种中不同细胞和基因活化所需的CpG-ODN的类型也不尽相同。因此，对于不同的物种以及不同的细胞和基因，需要有针对性地开展设计、改造和筛选。CpG-ODN还具有刺激型和抑制型两种不同的类型，前者具有激活免疫系统的功能，而后者具有抑制免疫系统的功能，这扩大了CpG-ODN制剂的应用范围，但同时也增加了其开发应用中设计和筛选的难度。CpG-ODN的免疫刺激和抑制功能由多种因素所决定，包括寡核苷酸链的长度、核苷酸的组成、CpG核心区两翼序列的结构以及关键核苷酸的修饰状态等，这些参数需要结合功能评价进行筛选和优化。我们通过对候选CpG-ODN序列的特殊设计，使得筛选出的序列片段具有合适的寡核苷酸链长度、CG岛数量、硫代磷酸骨架位点和高效特异结合宿主CpG受体Toll-like receptor 9(TLR9)的高级结构，经筛选的CpG-ODN序列具有高效诱导鱼类抗菌肽Hepcidin表达的功能。

本发明针对水产动物鱼类物种，以刺激肝脏组织中Hepcidin基因表达为目的，系统开展了刺激型CpG-ODN的设计、合成、修饰、筛选与功能评价等研究。利用模式实验动物斑马鱼研究模型，从预设计合成的19条候选CpG-ODN中，筛选到两条能高效诱导斑马鱼肝脏表达Hepcidin的CpG-ODN序列。功能研究显示，这两条CpG-ODN能在显著诱导肝脏表达Hepcidin的同时，降低血清中的铁离子浓度，从而抑制细菌生长。此外，CpG-ODN还抑制细菌表达OmpA膜蛋白，增强补体对细菌的杀伤力。免疫抗病试验结果表明，本发明所获得的CpG-ODN能显著保护实验鱼免受嗜水气单胞菌的感染，发病死亡率显著降低。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是人工合成鱼类种属和组织特异性CpG-ODN，用于诱导肝脏组织表达Hepcidin。利用斑马鱼实验模型，通过体内导入CpG-ODN，并结合Hepcidin表达分析、抗体阻断试验、铁离子含量测定、细菌生长抑制测定等功能评价试验，从预设计的19条含不同结构类型的CpG-ODN序列中，筛选出两种符合C型结构特征的CpG-ODN。发现其能特异性提高肝脏中Hepcidin的表达，降低血清中铁离子浓度，抑制细菌生长，显著提高实验鱼对嗜水气单胞菌等病原菌感染的免疫保护力。建立了一种利用诱导内源性Hepcidin高效表达从而实现鱼类免疫抗病的新技术。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种鱼类Hepcidin表达促进剂，所述促进剂为下列之一：CpG-ODN-C4：TCGTCGTCGAGCGAGGCAGTCGTT和

CpG-ODN-C5：GTCGTTTCGACGGGTGCAGTCGTT。

本发明还提供一种所述鱼类Hepcidin表达促进剂在制备免疫制剂中的应用。

进一步，所述免疫制剂为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染免疫抑制剂。

进一步，所述免疫制剂为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染免疫抑制剂。

本发明采用生物信息学结构模拟技术，设计各种颈环结构特征的19种CpG-ODN序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将19种CpG-ODN分别逐条注射斑马鱼，用荧光定量RT-PCR技术测定刺激前后肝脏组织中Hepcidin转录产物(mRNA)的变化水平，进行剂量依赖性统计分析。利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定刺激前后实验鱼血清铁离子浓度，利用平板抑菌试验测定细菌生长能力，然后统计分析肝脏Hepcidin诱导表达、血清铁离子浓度下降以及细菌生长抑制间的相关性。利用嗜水气单胞菌败血症感染模型，通过死亡率和成活率的统计分析，测定CpG-ODN的免疫保护功能。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所述促进剂能高效诱导抗菌肽Hepcidin表达，继而大大提高鱼类针对细菌性感染时的存活率。同时，本发明所提供的促进剂为一类无污染的短核苷酸序列，能在自然环境中分解。相对于传统的抗生素、磺胺类抗菌药，本发明所提供的促进剂制备的抗菌免疫制剂是一种典型的具有高效抗菌功能的环境友好型制剂。

(四)附图说明

图1是本发明所设计的各型CpG-ODN以及嗜水气单胞菌基因组DNA(A.h DNA)对斑马鱼抗菌肽Hepcidin诱导作用的荧光定量RT-PCR检测结果；

图2是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5对斑马鱼抗菌肽Hepcidin的刺激作用的荧光定量PCR，ELISA和Western Blot的检测结果；A为CpG-ODN-C4诱导肝脏组织Hepcidin转录水平变化，B为CpG-ODN-C5诱导肝脏组织Hepcidin转录水平变化，C为CpG-ODN-C4诱导血清中Hepcidin蛋白浓度变化，D为CpG-ODN-C5诱导血清中Hepcidin蛋白浓度变化，E为CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5刺激后Western Blot检测血清中Hepcidin表达浓度变化。

图3是经Hepcidin抗体处理后斑马鱼血清抑菌能力变化的检测结果；A为CpG-ODN-C4刺激后斑马鱼血清抑菌动力学曲线测定，B为CpG-ODN-C5刺激后斑马鱼血清抑菌动力学曲线测定。

图4是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5注射斑马鱼后血清中亚铁离子浓度变化的检测结果；A为CpG-ODN-C4刺激后斑马鱼血清铁离子浓度变化，B为CpG-ODN-C5刺激后斑马鱼血清铁离子浓度变化。

图5是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5增强斑马鱼抵抗嗜水气单胞菌的免疫保护作用；A为CpG-ODN-C4刺激后A.h细菌侵染条件下斑马鱼存活数统计，B为CpG-ODN-C5刺激后A.h细菌侵染条件下斑马鱼存活数统计，C为CpG-ODN-C4刺激后V.a细菌侵染条件下斑马鱼存活数统计，D为CpG-ODN-C5刺激后V.a细菌侵染条件下斑马鱼存活数统计。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、具有潜在激活鱼类Hepcidin表达能力的CpG-ODN序列的设计与合成：

本发明所设计的CpG-ODN均为偏酸性无甲基化修饰，部分或全序列硫代修饰的寡核苷酸片段，所设计的各型CpG-ODN的序列见表1(名称标注为字母加数字，字母代表其CpG-ODN类型，硫代修饰位点字体加粗)。CpG-ODN序列由上海捷瑞生物工程有限公司利用德国PolyGen 96柱DNA/RNA合成工作站代为合成。

表1.本发明所设计的CpG-ODN序列

实施例2、荧光定量RT-PCR检测各型CpG-ODN对斑马鱼Hepcidin的诱导作用：

实验鱼为实验室繁育的斑马鱼(体重3-4克)，饲养于标准28℃恒温饲养设施，实验前训化并观察2周，确认健康后进行实验。将人工合成的各型CpG-ODN用灭菌PBS稀释为1.0μM的浓度，分别以腹腔注射的方式注射成体斑马鱼，注射体积为10μL。24h后提取斑马鱼的肝脏组织，另设置以相同体积的PBS注射的斑马鱼肝脏组织作为阴性对照。按照Trizol试剂盒的说明，从斑马鱼肝脏中提取总RNA，利用TaKaRa的3-Full RACE Core Set试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以该cDNA作为模板，用引物Hepcidin F1、R1对抗菌肽Hepcidin的转录表达水平进行荧光定量PCR(以下简称qPCR)检测。荧光定量PCR扩增体系组成见表2；PCR引物见表3；qPCR程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸20秒，共40个循环，以β-actin的表达作为内参，qPCR结果用2^-ΔΔCt值法处理分析Hepcidin的相对表达差异。结果显示，在同一浓度刺激的条件下，本发明所设计的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5CpG-ODN对Hepcidin表达的诱导刺激作用最高，与其他实验组相比较，显著性上调了Hepcidin表达(图1)。注：“*”号表示数据间有显著性差异(P<0.05)。

表2.斑马鱼Hepcidin qPCR扩增体系

表3.斑马鱼Hepcidin qPCR引物

实施例3、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5诱导Hepcidin表达的剂量依赖效应

分别以0.5μg、1.0μg和1.5μg的浓度(将人工合成的CpG-ODN用灭菌PBS稀释)，将合成的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5腹腔注射成体斑马鱼，注射量为10μL；另设对照组，即以10μL的无菌生理盐液(PBS)腹腔注射成体斑马鱼。注射后24小时，分别提取斑马鱼的肝脏组织与血液。肝脏RNA提取以及逆转录和荧光定量PCR检测过程同实施例2内容，相关qPCR体系参见表2，Hepcidin引物序列参见表3。血液于4℃静置4h后离心取血清，用ELISA法测定血清中Hepcidin蛋白浓度；同时将血清进行Western Blot检测。

ELISA实验包被液为：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.94g，双蒸水定容至1L并调pH值为9.6。封闭液为：1L PBS中加入0.05g BSA以及10μL Tween-20。底物溶液为：配制底物缓冲液Na₂HPO₄·12H₂O 9.2g加柠檬酸2.35g加水定容至500mL并调pH至5.0。取底物缓冲液9.5mL加TMB 0.5mL及40μL 0.75％的H₂O₂混合后即为底物液(底物液需现配，配制完成15分钟内使用)。ELISA实验采用抗原(血清中的Hepcidin)包被的间接法：将各血清组测量蛋白浓度，浓度调为一致后以1比100的稀释倍数用包被液4℃包被12小时，然后使用本实验室制备的兔抗Hepcidin多克隆抗体以及购自Promega公司的羊抗兔IgG-HRP进行ELISA实验，底物液显色终止后利用酶标仪读取各实验孔吸光值OD450和OD630的数值，将每孔OD450的数值减去OD630的数值后即为待测血清中Hepcidin的相对浓度值。Western blot实验封闭液为：10mL PBS中加入5mg BSA。显色液为：选用购自美国Millipore公司的Immobilon Western HRP底物化学发光试剂盒(A液与B液等比例混匀使用)。

结果显示，经CpG-ODN-C4及CpG-ODN-C5注射刺激后的斑马鱼Hepcidin表达量显著上升，且对两种CpG-ODN的刺激具有浓度剂量效应(图2)。注：“*”号表示数据间有显著性差异(P<0.05)，“**”号表示数据间有极显著差异(P<0.01)。

实施例4、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5所诱导的Hepcidin的抗菌作用

采用抗Hepcidin抗体处理经CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5诱导的血清，测定血清抑菌能力的变化，分析CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5所诱导的Hepcidin的抗菌作用。

取两组成体斑马鱼，其中一组20尾，每尾腹腔注射10μL PBS作为对照；另一组取40尾，每尾腹腔注射1.5μg(PBS稀释)的本发明所设计的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5作为实验组，注射量为10μL。24小时后从各组斑马鱼采血，将血液4℃静置4h后离心取血清。将实验组血清平分为两份，一份血清不做任何处理待用；另一份血清等体积混入滴度效价为1:1000的兔抗Hepcidin多克隆抗体，在37℃条件下反应2小时后(使兔抗Hepcidin多克隆抗体与经CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5刺激后的斑马鱼血清进行反应)待用。另将处于对数生长期的嗜水气单胞菌(A.h)等体积接种于三管LB培养液中(每管含LB液体培养基2mL)，测得接种后各管实时的菌液浓度菌落形成单位值(CFU)一致。将上述三种斑马鱼血清(即对照、未做处理的实验组血清和兔抗Hepcidin多克隆抗体处理的实验组血清)分别加入三管培养基中(每管加入血清量为100μL)，在恒温摇床中以37℃、200rpm的条件下培养。培养后1、3、6、9和12小时分别各取100μL培养液测量菌液浓度CFU值。实验重复3次。

结果显示，经CpG-ODN-C4(图3中A)或CpG-ODN-C5(图3中B)刺激后斑马鱼血清的抑菌能力得到了显著提升；但经Hepcidin抗体中和处理后的斑马鱼血清的抑菌能力则受到了抑制。表明斑马鱼血清中的Hepcidin在抑制嗜水气单胞菌活性的过程中发挥作用。注：“*”号表示数据间有显著性差异(P<0.05)，“**”号表示数据间有极显著差异(P<0.01)。

实施例5、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5诱导斑马鱼血清铁离子含量下降

取两组成体斑马鱼，每组各10尾。其中一组每条鱼腹腔注射10μL、1.5μg本发明所设计的CpG-ODN-C4，另一组每条鱼腹腔注射10μL、1.5μg本发明所设计的CpG-ODN-C5；对照组设PBS和空白对照，24h后取血，取血后将血液离心取血清，血清经65％硝酸60℃处理2小时后利用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定铁离子浓度，实验重复3次。结果显示，PBS组的铁含量在22-24ppm左右，而CpG-ODN-C4与CpG-ODN-C5刺激组的铁含量均在15ppm左右，PBS组和control组间无显著差异，而CpG刺激组与对照组相比铁离子浓度均呈现显著降低(图4)。注：“*”号表示数据间有显著性差异(P<0.05)。

实施例6、CpG-ODN-C4与CpG-ODN-C5的免疫保护功能

取八组成体斑马鱼，每组各30尾。实验组分别腹腔注射CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5(每尾10μL、1.5μg)，对照组腹腔注射相同体积的无菌PBS。12h后将实验组、对照组的斑马鱼分别腹腔注射10μL/CFU 1.0×10⁶的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,A.h,菌种编号1.927，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC))(图5中A)和10μL/CFU 1.5×10⁶的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,V.a，菌种编号ATCC 17749，来源同A.h细菌)(图5中B)，对照组均不做任何处理。从24h开始，每隔24h统计斑马鱼的存活率，并计算注射过CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑马鱼组在各个时间点(0d～6d)的相对免疫保护率(1-实验组死亡率/对照组死亡率×100％)，试验重复3次。结果显示，相对于未注射CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑马鱼，注射了CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑马鱼在被A.h细菌感染后死亡率明显降低，其中CpG-ODN-C5实验组相对于对照组有近24％的相对免疫保护率；CpG-ODN-C4实验组相对于对照组也有20％的相对免疫保护率。其免疫保护率有了显著提高(P<0.05)；而对照组则在实验过程中没有发病现象(表4)。注：“*”号表示数据间有显著性差异(P<0.05)，“**”号表示数据间有极显著差异(P<0.01)。

表4.两种CpG-ODN对A.h或细菌感染斑马鱼的免疫保护率

综上所述，本发明中，经设计合成的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5注射成体斑马鱼，可高效激活斑马鱼Hepcidin表达及Hepcidin介导的免疫抗菌应答。这种安全、高效、环境友好型的核酸类免疫抗病制剂将为开发新型鱼类抗病药物以及新型鱼类疫苗的研究提供了一个全新的方向。

应当注意的是，以上实验列举的仅仅是本发明的若干具体实例，显然，本发明还有许多变形，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种鱼类Hepcidin表达促进剂及其应用

<130>

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

ggtcggacgt tcgagggggg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

ggtcggtcgt tcgagggggg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

ggtcgaacgt tcgagggggg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

ggtcggtcgt ccgagggggg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

ggtcgacggg tcgagggggg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

tcgtcggacg ttacgtcgtt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

tcgtcggtcg ttacgtcgtt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

tcgtcgaacg ttacgtcgtt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

tcgtcggtcg tcacgtcgtt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

tcgtcgacgg gtacgtcgtt 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

tcgtcgtcga tcgatcgagt cgtt 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

tcgtcgtcga ccggtgcagt cgtt 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

tcgtcgtcga tcgatgcagt cgtt 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

tcgtcgtcga gcgaggcagt cgtt 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

gtcgtttcga cgggtgcagt cgtt 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 16

tcgtcggacg tttcgagtcg tt 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

tcgtcggtcg tttcgagtcg tt 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

tcgtcgaacg tttcgagtcg tt 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 19

tcgtcggtcg tctcgagtcg tt 22