运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种利用环介导恒温基因扩增（loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP）技术进行菌样快速检测的试剂盒，具体涉及一种运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

近几年随着人口和工业的快速连续增长大大加速了能源消耗，导致全球面临潜在的能源危机。同时伴随着燃料价格的不断提高和化石燃料的急剧缩减，这就促使了全球寻找可替代的可再生能源。其中生物燃料被认为是传统化石燃料最主要的替代品。生物乙醇是一种可再生能源，它的消费过程不仅解决了传统燃料的环境污染问题，解决了农林产品的下脚料给环境带来的巨大污染，而且还大大降低了获得矿物质能源的成本。生物发酵法生产乙醇在一些国家和地区被广泛使用，巴西每年以甘蔗作为原料，生产1100万吨燃料乙醇；美国则每年大约生产550万吨以上的燃料乙醇；目前我国生物乙醇年产量为300多万吨，仅次于巴西、美国列世界第三。

运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis,Zm）为兼性厌氧的革兰氏阴性细菌，主要通过 Entner-Doudoroff（ED）途径代谢葡萄糖、果糖和蔗糖等，其独特的代谢途径和高效的乙醇发酵特性使得该菌株在食品、医药、化工和生物能源等领域存在巨大的应用潜力，因而对运动发酵单胞菌的研究也在不断深入。运动发酵单胞菌有快速高产的将葡萄糖转化为乙醇、可以耐受高温、乙醇浓度和糖浓度、非耦联的生长和发酵即醇生产过程与生长不相关等特点，使其在产醇方面的应用尤其得到重视。

目前针对运动发酵单胞菌有多种检测方法。传统的增菌培养方法一般需要10天以上，周期较长，并且需要使用实验动物，成本较高；免疫学检测（Immunoassay，IA）是一种根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知抗体或利用已知的抗体检测未知抗原的技术，主要包括酶联免疫吸附（ELISA）、放射免疫（RIA）、反向间接血凝法（RPHA）和反向乳胶凝集实验（RPLA）等，此类方法周期短，一次可检测大量样本，并且不需实验动物，但其缺点是必须有高亲和性的抗体；实时荧光定量PCR方法能够用于病原菌的检测，但对仪器设备和人员的专业技术水平要求较高，并且操作复杂，耗时较长，限制了该技术的推广。

DNA环介导恒温核酸扩增技术（LAMP）是一种新型的恒温核酸扩增方法，此技术克服了以往基因扩增方法的不足，能够在恒温条件下进行核酸的扩增，具有简单、快速、成本低和特异性强等优点，适于现场检测，有较好的应用性。目前，还没有专门针对运动发酵单胞菌的环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法的相关记载。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种快速灵敏准确的运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案：运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括：

（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水组成；

（2）反应液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1和40μmol/L内引物2组成，引物序列如下：

外引物1：GTGCAAGATGCGTTGGAAAC，

外引物2：GGCGTTGATATCGTGATGGA，

内引物1：GCGATGTTGATCGCACCGTTGT-CTTGTCATCTGCGGTCAGG，

内引物2：AGCCGGAGCAGAAATCAGAACC-CGGGTATCTTCACCAACACC；

（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；

（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；

上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L内引物1 1μL和40μmol/L内引物2 1μL。

本发明所述的运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为：

步骤（1），提取待检样品的基因组DNA；

步骤（2），环介导恒温扩增反应，取2μL待检样品DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，将配置好的反应体系在65℃扩增反应50-70min后取出待检；

步骤（3），分析判断反应结果，在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。

本发明根据运动发酵单胞菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gap设计了四条特异性引物，该基因序列为运动发酵单胞菌所共有，以保证检测不同来源的运动发酵单胞菌的可靠性。本发明采用LAMP技术，针对运动发酵单胞菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其它任何分析设备，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低和操作简便等优点，可用于运动发酵单胞菌的快速检测。

附图说明

图1是不同菌株的阳性扩增结果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明中试剂盒及检测方法的建立和应用作进一步说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。

实施例1

运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法的建立

步骤（1），引物的设计、合成试剂盒的组装

本实施例确定用于检测的引物序列如下：

外引物1：GTGCAAGATGCGTTGGAAAC，

外引物2：GGCGTTGATATCGTGATGGA，

内引物1：GCGATGTTGATCGCACCGTTGT-CTTGTCATCTGCGGTCAGG，

内引物2：AGCCGGAGCAGAAATCAGAACC-CGGGTATCTTCACCAACACC；

在此基础上设计用于运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：

（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO₄）、5 mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH₂O）组成；

（2）反应液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）组成；

（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；

（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；

上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO₄）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH₂O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。

步骤（2），待检样品的制备

采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA

检测菌种运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis，Zm）来源于河南师范大学应用微生物实验室保藏的菌种。使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取样品基因组DNA。

步骤（3），进行环介导恒温扩增反应

（1）取2μL待检样品DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶；

（2）将配制好的反应体系在65℃扩增反应50min后取出待检。

步骤（4），分析判断反应结果

在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检菌株为运动发酵单胞菌。

实施例2

阴性对照

步骤（1），引物的设计、合成试剂盒的组装

本实施例确定用于检测的引物序列同实施例1。

在此基础上设计用于运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：

（1）反应液1：由10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁（MgSO₄）、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水（ddH₂O）组成；

（2）反应液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L内引物1（FIP）和40μmol/L内引物2（BIP）组成；

（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；

（4）显色剂：质量浓度为10%的SYBR Green I荧光染料；

上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19μL，其组成为：10mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反应缓冲液2.5μL、150mmol/L硫酸镁（MgSO₄）1μL、5mol/L甜菜碱5μL和灭菌双蒸水（ddH₂O）6.5μL；反应液2折合每样品3μL，其组成为：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L内引物1（FIP）1μL和40μmol/L内引物2（BIP）1μL。

步骤（2），待检样品的制备

采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA

使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取铜绿假单胞菌、绿色魏斯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和肠炎沙门氏菌等7种细菌的基因组DNA。

步骤（3），进行环介导恒温扩增反应

（1）取2μL待检样品DNA溶液，加入19μL反应液1、3μL反应液2、1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶；

（2）将配制好的反应体系在65℃扩增反应50min后取出待检。

步骤（4），分析判断反应结果

在反应产物中加入1μL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。

如图1所示，编号为1-8的反应管分别对应铜绿假单胞菌、运动发酵单胞菌、绿色魏斯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和肠炎沙门氏菌。

所述的实施例1与实施例2中各阴性对照组比较，实施例1中产生阳性扩增结果，如图1中2号反应管，而不携带gap基因的实施例2阴性对照菌株没有产生阳性扩增结果，如图1中1号、3-8号反应管，从而证明本试剂盒及检测方法具有较强的特异性，对不携带gap基因的其它菌株不会产生假阳性结果。

以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南师范大学

<120> 运动发酵单胞菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgcaagatg cgttggaaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcgttgata tcgtgatgga 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgatgttga tcgcaccgtt gtcttgtcat ctgcggtcagg 41

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agccggagca gaaatcagaa cccgggtatc ttcaccaacacc 42