一种妊娠高血压的诊断系统的制作方法

文档序号:14514672阅读:200来源:国知局
一种妊娠高血压的诊断系统的制作方法
本发明属于免疫学领域,涉及一种trb-cdr3检测试剂和诊断系统在制备妊娠高血压诊断/筛查剂方面的应用以及一种妊娠高血压的诊断系统。
背景技术
:妊娠期高血压疾病(hdcp)是妇女妊娠期所患有的高血压疾病统称,分为妊娠期高血压、子痫前期、子痫、慢性高血压并发子痫前期以及慢性高血压。子痫前期是妊娠期高血压疾病中较重的类型,对母婴安全是一个严重的威胁,同时也是导致孕产妇及围生儿死亡的主要原因之一,围生儿死亡率可高达15%-30%。近年来的基础研究表明,妊娠的成功有赖于母胎免疫平衡,一旦免疫平衡失调,即可引起免疫排斥反应而导致子痫前期和先兆子痫。免疫系统是机体抵御病原菌入侵与免疫调节的重要系统,而t细胞受体(tcr)是人类基因组中最活跃的免疫大分子之一。t细胞受体(tcr)是t细胞表面产生识别抗原和介导免疫应答的分子,可分为tcrα/β和tcrγ/δ两种类型,外周血t细胞主要为tcrα/β的t细胞。tcrβ基因由可变区(v)、多变区(d)、结合区(j)和恒定区(c)四部分基因片段组成。在t细胞发育过程中,v、d、j区进行重排而形成具有功能的tcr编码基因,重排过程中v-d和d-j之间有不同数量的核苷酸随机插入或者删减的现象,这种基因片段连接的不准确性使得tcr的表达呈现多样性,以识别各种不同的抗原。已经揭示了tcrβ(trb)的多样性能与多种疾病的关系,如研究发现,癌症病人的tcrβ很相似,与健康人完全不同。通过tcrβ多样性特征,可以区分癌症病人和健康人。然而,此前,从未有人研究过trb-cdr3序列的多样性与妊娠期高血压疾病的关系。技术实现要素:本发明目的在于提供一种trb-cdr3检测试剂在制备妊娠期高血压诊断/筛查剂的应用。本发明的目的还在于提供一种妊娠高血压的诊断系统,其含有与妊娠期高血压相关的trb-cdr3核苷酸和/或氨基酸系列,通过将测试者的trb-cdr3多样性序列与本发明诊断系统的序列比对,可以得到测试则患妊娠高血压的敏感值。本发明的目的通过以下技术手段实现:本发明提供了一种trb-cdr3的检测试剂在制备妊娠期高血压诊断/筛查剂的应用。所述的检测剂含有多重pcr引物和高通量测序引物。所述的多重pcr引物为htcri引物;所述的htcri引物含有第一引物组和第二引物组。第一引物组具有选自seqidno:1-26所示的核苷酸序列;第二引物组具有选自seqidno:27所示的核苷酸序列。所述的检测剂还含有聚合酶。作为优选地,所述的聚合酶能够扩增几十kb的片段;其延伸速度为至少1kb/分钟;其稳健性为平均每kb引入的错误不多于1个。所述的第一诊断/筛查剂用于对样品的cdb-cdr3区域进行n重pcr扩增。作为优选地,n≥2,更优选n=2。所述的高通量测序引物选自seqidno:28-29所示的核苷酸序列本发明还提供了一种妊娠高血压的诊断系统,所述的诊断系统还有输入模块,数据比对模块和结果输出模块。a.输入模块:用以将数据信息输入系统,所述数据信息是诊断对象的trb-cdr3核苷酸序列和/或氨基酸序列;b.数据比对模块:用以将输入的数据信息与系统的预存数据进行匹配,所述预存数据为一条或以上的trb-cdr3序列与妊娠期高血压风险之间的关系数据;c.结果输出模块:用以将所述匹配所对应的妊娠期高血压风险数据输出;当所输入的数据信息与某一个预存的trb-cdr3序列匹配时,该预存trb-cdr3序列所对应的妊娠期高血压风险数据即为输出结果或作为输出结果的基础。所述的诊断对象为妊娠者。所述数据比对模块中的预存数据包含一条或多条trb-cdr3核苷酸序列,和/或包含一条或多条trb-cdr3氨基酸序列;进一步地,所述的预存数据包含seqidno:30-59的trb-cdr3核苷酸序列中的一个或多个:优选地,所述的预存数据包含seqidno:30-47的trb-cdr3核苷酸序列中的一条或多条;更优选地,所述的预存数据包含seqidno:30-35的trb-cdr3核苷酸序列中的一条或多条。进一步地,所述的预存数据包含seqidno:60-89的trb-cdr3氨基酸序列中的一条或多条:优选地,所述的预存数据包含seqidno:60-77的trb-cdr3氨基酸序列中的一条或多条;更优选地,优选地,所述的预存数据包含seqidno:60-65的trb-cdr3氨基酸序列中的一条或多条。当所输入的数据信息与某一个预存的trb-cdr3序列匹配时,则输出结果为具有风险或风险值;当所输入的数据信息与多个预存的trb-cdr3序列匹配时,则输出结果为具有风险值最高风险值。当所输入的数据信息不与任一个预存的trb-cdr3序列匹配时,则输出结果为无风险或低风险。所述的trb-cdr3序列与妊娠期高血压风险之间的关系数据包括下表1数据中的一组或多组:当出现下表中的组1-组30时,则出现有一定患病风险。优选地,其必定含有以下组1-组18数据中的一组或多组,当出现组1-组18,则为出现较高的患病风险。更优选地,其必定含有以下组1-组6数据中的一组或多组,当出现组1-组6,则为出现高的患病风险。表1本发明的妊娠高血压诊断系统还含有检测构件。所述的检测构件用以测定诊断对象的trb-cdr3核苷酸序列或氨基酸序列。所述的检测构件所采用的测定方法包含但不限于;基因组和转录组水平的q-pcr,基因组和转录组水平的pcr,测序,dna芯片和蛋白芯片中的一种。在本发明一示范性的实施例中,检测构件的测定方法为高通量测序,具体包含以下的步骤:s1.采孕妇外周血s2.细胞分离s3.rna提取s4.arm-pcr扩增s5.高通量测序s6.生物信息学分析步骤s4中,arm-pcr的引物为htcri引物。采用所述的诊断系统诊断/预测/预后妊娠高血压的方法,其特征在于,包含以下步骤:i)对测试者的外周血的trb-cdr3序列多样性测序;ii)将测试者的trb-cdr3多样性序列输入本发明的诊断系统进行比对,根据比对结果,诊断系统输出疾病相应的风险值/敏感值;iii)如果测试者有妊娠高血压的风险,则将其纳入观察或者治疗方案。发明人通过研究发现,健康孕妇与重度和轻度的子痫患者免疫组库的特点无明显的差异,且cdr3肽段数目与种类也无显著的差异。非显而易见的是,某些trb-cdr3的核酸和/或氨基酸序列与妊娠高血压息息相关,而且,不同的trb-cdr3的核氨酸和/或氨基酸序列显示与疾病不同的敏感性和特异性。因此,这些特定的trb-cdr3序列可以作为妊娠高血压疾病诊断/预测/预后的依据,当测试者含有上表1中特定的序列时,可以预测测试者的患妊娠高血压的风险值或敏感值。突出的是,当出现seqidno:30-47和/或seqidno:60-77中的任意一组trb-cdr3序列,显示出较高的特异性,表明这些序列可以作为妊娠高血压的指示性序列。发明人此前有研究过igh-cdr3序列的多样性与妊娠高血压疾病的关系(郭昌龙,杜蒙,王启迪.妊娠对孕妇外周血igh-cdr3免疫组库的影响[j].中国计划生育学杂志,24(5):292.),但是并未找到与妊娠高血压疾病相关性高、一致性较高的igh-cdr3肽段,证明b淋巴细胞在妊娠高血压疾病中缺乏特异性,不是该病的主要发病原因。但是发明人通过对t淋巴细胞的研究发现在t淋巴细胞中有一些trb-cdr3肽段在妊娠高血压患者中普遍存在,因此这些肽段的存在与否可以用来预测和诊断妊娠高血压疾病的发生。此外,本发明揭示了妊娠高血压对女性tbr-cdr3多样性和免疫学特性的影响,为全面揭示免疫耐受在妊娠过程中的作用和机制提供了重要的基础。附图说明图1trb-cdr3区域pcr产物电泳图图2trb-cdr3区域两次pcr的原理图3trb-cdr3免疫文库构建的流程具体实施方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案,具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。实施例1妊娠高血压trb-cdr3测试系统构建1)采血在获得知情同意书之后,抽取入选孕妇外周静脉血8-10ml,肝素钠抗凝,室温放置,4小时内完成细胞分离过程(入选孕妇的标准:正常孕妇为孕39周以上、胎儿与孕妇均健康、无输血史、孕妇孕期无妊娠期相关疾病且入院前三月无感染史;妊娠高血压孕妇入选标准:收缩压>140mmhg,舒张压>90mmhg,蛋白尿>0.3g/24h,或伴有头晕、水肿等其他全身症状)2)细胞分离a、用pbs将10ml抗凝血稀释至35ml,取15ml淋巴细胞分离液置于另一个50ml离心管中,置于室温;b、将稀释后的全血缓慢地加到15ml淋巴细胞分离液上(加血样时需小心,需确保加样后血液仍在分离液至少,不要将血样与分离液混合),20℃,400g离心25min(螺旋转子,不要brake,加速度1-2,brake0);c、弃掉包含pbs和血浆的上层液体,将中间的浑浊细胞层吸入另一个干净的50ml离心管中,确保把所有细胞均吸入,可以允许混有部分淋巴细胞分离液和血浆;d、加适量pbs,300g离心20min,弃掉上清,用80ulpbs重悬细胞,之后转移到5mltube中。(如果液体仍很浑浊可以重新清洗、离心一次);e、将20ulcd14磁珠加入淋巴细胞中,4°孵育15min,加入3mlpbs,混匀后3000rpm离心3min,弃掉上清;f、加入2mlpbs,将ls柱置于分离柱上,用3mlpbs洗柱一次,弃掉洗柱液;g、将细胞重悬液加入分离柱中,用新的收集管收集流出液,再加2mlpbs于分离柱中,继续收集流出液,分离后的ls柱及结合的细胞可以弃掉(cd14+细胞);h、收集的cd14-细胞3000rpm离心3min,弃掉上清,用80ulpbs重悬细胞。3)rna的提取将分选到的细胞用rna提取试剂盒提取细胞总rna(rneasyminikit,74104,qiagen,德国),用nanodrop测量rna浓度与质量。4)arm-pcr扩增取适量的细胞总rna作为模板,用美国irepertoire公司的htcri试剂盒分别进行逆转录与pcr扩增过程:trb-cdr3区域的扩增用htcri引物扩增。扩增的体系与条件分别如下:第一次pcr扩增体系(表2):表2trb-cdr35×buffer5dntp1rnasin0.25enzymemix1irepertoire引物4rna100-1000ngncclease-freeh2o适量共计25ultrb-cdr3区域第一次pcr扩增条件(表3):表3第二次pcr扩增体系(表4):表4trb-cdr3区域第二次pcr扩增条件(表5):表5trb-cdr3区域pcr产物如图1所示,其大小集中于270-300bp。切下目的条带并回收,用agilent2100对每例样品进行定量并检测纯度,如果纯度与浓度不够的话需要重新对pcr产物进行纯化。5)高通量测序a、将1-10个样品(步骤s4获得的样品)等摩尔量混合;b、将混合好的样品稀释1000倍,利用kapa二代测序文库定量试剂盒对其浓度进行测定,以内参样品phix作标准曲线,根据ct值计算样品的拷贝数;c、根据trb-cdr3片段的大小计算混合样品的摩尔浓度;d、将3.125um的phix内参与9.375um的待测样品混合,用naoh变性5分钟,然后加入htx溶液,使得终体积为1ml,终浓度为12.5pm;e、将illumina公司miseq测序试剂盒从-20℃冰箱取出,置于冰水中至完全融化,上下颠倒几次使试剂盒内液体混匀;f、吸取900ul稀释后的待测样品,加入miseq测序试剂盒中;g、设置miseq测序仪相关参数,进行测序反应;h、约40小时后测序反应结束,用0.25%triton100溶液对机器进行清洗维护,测序得到的原始数据上传到生物信息服务器进行保存与分析。6)生物信息学分析a、将测序得到的原始数据解压;b、将无communal序列的reads结果过滤掉,得到测序结果的cleandata;c、根据每个样品所用扩增引物5’端barcode序列的不同将同一条lane中的不同样品区分开;d、根据pair-endmatch的原理将一个样品内两端测序结果相互匹配的read拼接成一条完整的read;e、将拼接好的序列与imgt数据库(http://www.imgt.org/)中的信息进行blast比对,鉴定出v区、d区、j区的核苷酸序列,同时翻译为相对应的氨基酸序列;f、针对同一个read在样本测序结果中进行筛查,查找出相同read的频率数以及虽然read的cdna不同但编码相同蛋白的read数目;h、对样本中编码的不同肽段的种类与频率进行统计。6)数据分析a、根据样本的病例信息对样本进行分组;b、根据分组结果对各组样本间的肽段进行进一步分析统计,主要包括:组内样本间有无相同的肽段及各自的频率、通过对组间数据的比较查找组内样本间特有的肽段与疾病相关的肽段。7)研究结果表6健康孕妇的数据-trbno.=47readscdr3uniquecdr3d50age平均值898750.33888005.76198795.8095243.85714285730.48标准差387069.9562382872.105410622.782924.8255125562.758标准误8235.5309828146.215009226.0166580.102670480.068表7妊娠高血压患者(血压<160)-trb表8妊娠高血压患者(血压>160)-trb8)研究结论妊娠高血压患者trb-cdr3免疫组库特点:1)cdr3肽段的数目与种类在健康孕妇、轻度先兆子痫、重度先兆子痫个体间无明显差异;2)trb-cdr3免疫组库的特点在健康孕妇、轻度先兆子痫、重度先兆子痫个体间无明显差异;3)通过比较发现一些核苷酸或氨基酸序列的表达与妊高症的发生高度相关,具体的序列及敏感性、特异性如下表9所示。敏感性和特异性的计算方法如下:诊断试验的四格表病例组非病例组诊断阳性(真阳性)ab(假阳性)a+b试验阴性(假阴性)cd(真阴性)c+da+cb+da+b+c+d敏感性(sen)=a/(a+c)特异性(spe)=d/(b+d)阳性似然比(+lr)=sen/1-spe阴性似然比(-lr)=(1-sen)/spe准确度=a+d/(a+b+c+d)患病率(即验前概率)=a+c/(a+b+c+d)验前比(pre-testodds)=患病率/(1-患病率)验后比(posr-testodds)=验前比×阳性似然比验后概率(post-testprobability)=验后比/(验后比+1)表9实施例2一种妊娠高血压的诊断/筛选方法一种妊娠高血压诊断系统,其含有:a.输入模块:用以将数据信息输入系统,所述数据信息是诊断对象的trb-cdr3核苷酸序列和/或氨基酸序列;b.数据比对模块:用以将输入的数据信息与系统的预存数据进行匹配,所述预存数据为一条或以上的trb-cdr3序列与妊娠期高血压风险之间的关系数据;c.结果输出模块:用以将所述匹配所对应的妊娠期高血压风险数据输出;当所输入的数据信息与某一个预存的trb-cdr3序列匹配时,该预存trb-cdr3序列所对应的妊娠期高血压风险数据即为输出结果或作为输出结果的基础。所述数据比对模块中含有预存数据为seqidno:30-59的trb-cdr3核苷酸序列:和含seqidno:60-89的trb-cdr3氨基酸序列。所述的trb-cdr3序列与妊娠期高血压风险之间的关系数据包括表1中组1到组78的数据。采用上述的妊娠高血压诊断系统诊断/预测/预后/筛选妊娠高血压患者,包含以下步骤:1)采取诊断对象(妊娠者)外周血,同实施例1;2)外周血细胞分离,同实施例1;3)提取rna,同实施例1;4)arm-pcr扩增,同实施例1,5)高通量测序,同实施例1;6)生物信息学分析得到诊断对象的trb-cdr3免疫文库;7)将诊断对象的免疫文库输入本发明的诊断系统进行比对,根据比对结果,诊断系统的输出模块输出妊娠高血压的患病风险值;8)如果测试者有妊娠高血压的风险,则将其纳入观察或者治疗方案。在本实施例中,所选取的诊断对象(妊娠者)无比对结果,输出的风险值为0(或无风险)。通过测量诊断对象的血压,其血压为正常血压,表明本发明的诊断系统具有准确性。sequencelisting<110>国家卫生计生委科学技术研究所<120>一种妊娠高血压的诊断系统<130>pt20162123-dd-p<160>89<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>未知<400>1gcacaacagttccctgacttgcac24<210>2<211>24<212>dna<213>未知<400>2tcatcaaccatgcaagcctgacct24<210>3<211>24<212>dna<213>未知<400>3gtctctagagagaagaaggagcgc24<210>4<211>24<212>dna<213>未知<400>4acatatgagagtggatttgtcatt24<210>5<211>25<212>dna<213>未知<400>5atacttcagtgagacacagagaaac25<210>6<211>24<212>dna<213>未知<400>6ttccctaactatagctctgagctg24<210>7<211>20<212>dna<213>未知<400>7aggcctgagggatccgtctc20<210>8<211>22<212>dna<213>未知<400>8cctgaatgccccaacagctctc22<210>9<211>24<212>dna<213>未知<400>9atttactttaacaacaacgttccg24<210>10<211>24<212>dna<213>未知<400>10cctaaatctccagacaaagctcac24<210>11<211>24<212>dna<213>未知<400>11ctccaaaaactcatcctgtacctt24<210>12<211>24<212>dna<213>未知<400>12tcaacagtctccagaataaggacg24<210>13<211>18<212>dna<213>未知<400>13aaaggagaagtctcagat18<210>14<211>18<212>dna<213>未知<400>14caaggagaagtccccaat18<210>15<211>18<212>dna<213>未知<400>15ggtgagggtacaactgcc18<210>16<211>24<212>dna<213>未知<400>16gtctctcgaaaagagaagaggaat24<210>17<211>24<212>dna<213>未知<400>17agtgtctctcgacaggcacaggct24<210>18<211>24<212>dna<213>未知<400>18aaagagtctaaacaggatgagtcc24<210>19<211>21<212>dna<213>未知<400>19cagatagtaaatgactttcag21<210>20<211>24<212>dna<213>未知<400>20gatgagtcaggaatgccaaaggaa24<210>21<211>24<212>dna<213>未知<400>21caatgccccaagaacgcaccctgc24<210>22<211>24<212>dna<213>未知<400>22agctctgaggtgccccagaatctc24<210>23<211>20<212>dna<213>未知<400>23gattcacagttgcctaagga20<210>24<211>22<212>dna<213>未知<400>24cagagaagtctgaaatattcga22<210>25<211>21<212>dna<213>未知<400>25gatcgattctcagctcaacag21<210>26<211>24<212>dna<213>未知<400>26aaagattttaacaatgaagcagac24<210>27<211>18<212>dna<213>未知<400>27ttctgatggctcaaacac18<210>28<211>58<212>dna<213>未知<400>28aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>29<211>61<212>dna<213>未知<400>29caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaaccgctcttccgatc60t61<210>30<211>36<212>dna<213>未知<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>nisa,c,g,toru<400>30gcntcntcnggncarggntcntcntaygarcartay36<210>31<211>33<212>dna<213>未知<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>nisa,c,g,toru<400>31gcntcntcnttyggntcnacntaygarcartay33<210>32<211>36<212>dna<213>未知<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>nisa,c,g,toru<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>nisa,c,g,toru<400>32gcntcntcnct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