一种人脐带血免疫细胞库的构建方法与流程

本发明涉及一种细胞库的构建方法，尤其涉及一种人脐带血构建免疫细胞库的方法。

背景技术：

免疫细胞，泛指所有参与免疫反应的细胞，也特指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞。免疫细胞治疗是采集人体免疫细胞，在多种免疫活性因子的作用下，经过体外培养，大量扩增免疫效应细胞后，再回输到体内，杀灭血液及组织中的病原体和癌细胞。目前，用于临床治疗的免疫细胞主要有树突状细胞（DC）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、DC刺激的CIK细胞（DC-CIK）、自然杀伤细胞（NK）、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）等。

免疫细胞治疗已成为继手术、化疗、放疗三大传统疗法后的第四种肿瘤治疗技术，弥补了手术、放化疗等常规疗法无法完全杀灭体内残余癌细胞的缺点，还能防止肿瘤复发与转移，达到控制甚至治愈癌症的目的，在临床上的使用越来越广泛。

目前，临床上的免疫细胞治疗均是将血液中分离的单个核细胞诱导扩增成足量的免疫细胞后回输。而这种治疗方式存在几个不可避免的问题：（1）由于釆血后的单个核细胞分离及诱导培养，病人若选择免疫细胞治疗至少需等待两周时间，容易错过最佳治疗期，且住院时间延长；（2）癌症患者尤其是晚期癌症患者，体质虚弱、免疫功能低下，一般不能耐受反复抽血（如容易诱发缺血性贫血等），因此所得的自体血量较少，而一次培养只能扩增70-80倍左右，难以满足免疫细胞治疗所需细胞数量，临床医生需在细胞治疗和反复抽血之间平衡；（3）病人自体血液的质量不高，尤其是抗原递呈细胞（DC细胞即是最高效的抗原递呈细胞）数量较少，而免疫抑制细胞（Treg细胞）数量较多，诱导培养时免疫抑制细胞数量也在不断增加，将在一定程度上继续抑制效应细胞；（4）临床上的免疫细胞治疗（DC-CIK）多选用全抗原负载的模式（如CN102861107B），治疗的靶向性不强，存在移植物抗宿主反应的风险。

脐带血是脐带及胎盘内近胎儿一侧血管内的血液，来源充足，采集方便，免疫源性较弱，能更大程度上耐受HLA（人类的主要组织相容性复合体）配型不服；脐带血内的淋巴细胞绝对数量高，具有较强的增殖潜力；由脐带血分离诱导后进行免疫细胞治疗，可突破免疫细胞只进行自体治疗的瓶颈，满足不同人群对细胞治疗的需求。

在免疫细胞库建设过程中还需考虑细胞冻存的问题，目前的细胞冻存液中DMSO（二甲基亚砜）的含量一般均在10%-15%，即便是在冻存免疫细胞的专利（CN102758259B）中，依然将DMSO控制在10%。但是单个核细胞，尤其是诱导后的淋巴细胞是脆弱的，由于DMSO的毒性作用及冻存过程中的机械操作，易造成免疫细胞膜上的某些蛋白构型的改变，从而引起细胞亚型变化，导致穿孔素分泌量下降；另一方面，细胞在复苏处理时还需注意对DMSO的清除处理，已有报道指出细胞治疗的不良事件发生率与DMSO的回输量有关。

综上所述，研究一种可以满足临床中细胞治疗需要的免疫细胞库的构建方法，显得尤为重要。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种人脐带血构建免疫细胞库的方法，该方法可提高细胞质量，增强细胞治疗效果。

为实现本发明的上述目的，本发明提供一种人脐带血免疫细胞库的构建方法，该构建方法包括以下步骤。

步骤1、脐带血的采集及运输。

步骤2、从脐带血中分离单个核细胞。

步骤3、将步骤2得到的单个核细胞内的CD34^＋细胞诱导成DC细胞：用AIM-V培养基调整单个核细胞密度；然后接种至培养瓶中，同时加入DC诱导因子，置二氧化碳培养箱中进行培养；培养至第2-3天时，加入rhGM-CSF、rhIL-4和rhIL-15，置二氧化碳培养箱继续培养。

步骤4、从上清培养液中分离悬浮的淋巴细胞：步骤3培养的细胞培养至第3-4天时，将培养液转至无菌离心管中，再往培养瓶中加入生理盐水，晃动洗涤，收集残留悬浮的淋巴细胞。

步骤5、获得成熟的DC细胞：向步骤4洗涤后的培养瓶中加入AIM-V培养基，加入rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhGM-CSF和rhIL-4，置二氧化碳培养箱，继续培养贴壁细胞；当培养至第6天时，半量换液，回收移出液中的悬浮细胞，补充rhGM-CSF和rhIL-4，并加入单一特异性肿瘤抗原肽进行负载，置二氧化碳培养箱中，继续培养；当培养至第7天时，加入rhTNF-α，置二氧化碳培养箱，继续培养；当培养至第9天时，细胞变为毛刺状悬浮细胞，即为成熟的DC细胞，终止培养。

步骤6、获得CIK细胞：将步骤4中的悬浮的淋巴细胞离心弃上清，用AIM-V培养基调整细胞密度后，接种到培养袋中，加入IFN-γ混匀，置二氧化碳培养箱培养；培养24h后，加入rhIL-2、rhIL-15、CD3；然后每2-3天，2倍量添加培养液AIM-V培养基, 并补加rhIL-2；当培养至第7天时，将培养袋内的悬浮细胞转移到WAVE Bioreactor system 10中，继续进行培养8天，获得CIK细胞。

步骤7、收集DC-CIK细胞：将步骤5得到的成熟的DC细胞离心，用AIM-V培养基重悬细胞，加入WAVE Bioreactor system 10中，与步骤6培养至第8天得到的悬浮细胞（CIK细胞）共培养；然后再添加AIM-V培养基，并补加rhIL-2、rhIL-15；共同培养至第14-16天时，离心收集共培养的细胞，即为DC-CIK细胞。

步骤8、对收集的DC-CIK细胞进行检测。

步骤9、检测合格后，放入免疫细胞库冻存，并建立细胞档案：将检测合格的DC-CIK细胞与预冷的细胞冻存液混合后封装，附上标签，转至液氮罐内。

步骤10、根据临床诊断从免疫细胞库内选择对应的效应细胞种类，复苏培养24h后，回输。

所述步骤1中脐带血采集后需加入抗凝剂；所述的抗凝剂为肝素或枸橼酸钠。

所述步骤3中采用的DC诱导因子为rhSCF、rhFLT-3L、TPO、rhIL-3和rhIL-11，各诱导因子的用量均为5-100ng/ml。

所述步骤5中肿瘤抗原肽是针对各种肿瘤疾病的特异性抗原肽，优选CEA癌胚抗原、AFP甲胎蛋白。

所述步骤5中获得的成熟DC细胞是针对单一肿瘤抗原肽的效应细胞。

所述步骤9中细胞冻存液的配方为5%DMSO，10%羟乙基淀粉，85%稳定剂；其中稳定剂由25%人血白蛋白，5%乙二醇，70%培养基组成；羟乙基淀粉可用右旋糖酐40代替。

所述步骤9细胞档案需详细记录抗原肽负载类型；细胞档案需建立电子版档案和纸质版档案。

所述步骤9免疫细胞库是针对不同肿瘤抗原肽的多种效应细胞的集合。

所述步骤9冻存的细胞密度控制在1-5×10⁸/ml。

所述步骤10细胞复苏培养需加入rhIL-2、rhIL-6、rhIL-15进行培养。

本发明的有益效果。

本发明提供的人脐带血免疫细胞库的构建方法，采用人脐带血作为免疫细胞库的细胞来源，不仅活性高，扩增速度快，而且脐带血中含有丰富的造血干细胞，可塑性好，免疫原性低，大量实践证明脐带血来源的造血干细胞可帮助白血病患者完成造血和免疫功能的重建，采用人脐带血作为免疫细胞库的细胞来源，在保证血源充足的同时，既可避免采血给病人带来的痛苦，又可提高细胞质量（脐带血内的淋巴细胞绝对数量高，增值潜力强，且不存在免疫抑制细胞），增强细胞治疗效果。

本发明与现有的构建方法相比，本发明构建方法的构建速度快，且通用性好。构建的免疫细胞库是各种肿瘤抗原肽效应细胞的集合，患者可在需要进行细胞治疗时选择合适的效应细胞复苏回输，单一抗原肽产生的效应细胞回输能降低移植物抗宿主反应，增强效应细胞靶向性，减少等待细胞培养的时间，把握最佳治疗期，提高临床治疗效果。该构建方法将CD34^＋细胞诱导成DC细胞，进而可增加负载抗原的DC数量，亦能在共培养过程中更好地刺激悬浮细胞的生长；并且，利用单一肿瘤特异性抗原肽对DC进行抗原负载，并根据肿瘤临床检测结果进行组合应用，增强免疫细胞治疗的靶向性，降低移植物抗宿主病发生几率，提高治疗安全性。抗凝剂不采用EDTA,EDTA是钙镁等离子螯合剂，能够抑制核酸酶的活性，影响细胞分裂。本发明的细胞冻存液采用5%的DMSO，DMSO能显著地改变细胞内许多酶的活性，抑制蛋白的合成；改变细胞的呼吸功能，使细胞耗氧量下降；它还是一种自由基清除剂，可减轻冷冻及复温过程中产生的自由基对细胞的损害，但DMSO有一定的毒性，并且研究表明5%浓度的DMSO比10%浓度的 DMSO更有利于减少CD34^＋细胞的凋亡和坏死，冻存后细胞的活力也高。

附图说明

图1为培养至第6天时，初分化的DC细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为5×。

图2为培养至第9天时，成熟的DC细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为20×。

图3为培养至第7天时，CIK细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为20×。

图4为培养至第9天时，CIK细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为20×。

图5为培养至第15天时，共培养细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率为20×。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1。

本实施例提供一种人脐带血免疫细胞库的构建方法，包括以下步骤。

步骤1、脐带血的采集及运输。

需要采集：脐带血采集时需对母体血和脐带血进行传染病筛查，并记录脐带血内CD34^＋细胞数，CD34^＋细胞的数目跟造血干细胞的数目直接相关，而本实施例的DC细胞由造血干细胞分化而来，对CD34^＋细胞的数量要求是不低于1×10⁵，筛查合格后方可使用。脐带血采集后需加入抗凝剂，抗凝剂为肝素。血样需在4℃条件下保存，12h内运至实验室。

步骤2、分离单个核细胞。

（1）稀释血样本：将血液分装至无菌离心管每管25ml，1200g条件下离心处理10min， 然后将上部血浆层用移液管吸出，下层为红细胞、白细胞、血红蛋白和血小板等有形成分；用生理盐水稀释剩余的有形成分，并充分混匀，定容至45ml，得到稀释的血标本。

（2）离心处理：取稀释的血标本，缓慢加入装有人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物科技有限公司，批号1501012600）的无菌离心管中，500g条件下离心处理30min。

（3）细胞处理：离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、人淋巴细胞分离液Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层；吸取血浆生理盐水层弃之，直至距单个核细胞层5mm处；将粒细胞层之上的所有液体转移至无菌离心管中，向离心管中补充与转移液体等体积的生理盐水，混匀后300g离心10min，去除上清，得到单个核细胞。

步骤3、将单个核细胞内的CD34^＋细胞诱导成DC细胞，从而增加贴壁细胞总量。

用AIM-V培养基（Gibco无血清T细胞培养基）将单个核细胞调整到2-5×10⁶/ml，之后接种至T75培养瓶中，每瓶约接种20ml细胞悬液；向每个培养瓶中加入DC诱导因子1ml（成分为：50ng/ml的rhSCF（重组人干细胞生长因子）、30ng/ml的rhFLT-3L（重组人Fms样酪氨酸激酶受体3-配体）、30ng/ml的TPO（促血小板生成素）、20ng/ml的rhIL-3（人重组白介素3）、20ng/ml的rhIL-11（人重组白介素11）；均为商业购买），置37℃、5% CO₂的二氧化碳培养箱培养。

培养至第2天时，加入1000U/ml的rhGM-CSF（重组人巨噬细胞集落刺激因子）200ul、500U/ml rhIL-4（重组人白介素4）200ul和500U/ml 的rhIL-15（重组人白介素15）200ul，置37℃、5% CO₂的二氧化碳培养箱继续培养。

步骤4、分离来自单核细胞层和Ficoll层的悬浮的淋巴细胞。

培养至第3天时，将培养液转至无菌离心管中，再缓慢往T75瓶中加入20ml生理盐水，轻轻晃动洗涤T75瓶，收集残留非贴壁细胞，即悬浮的淋巴细胞。

步骤5、选择肿瘤抗原肽对DC细胞进行抗原负载，获得成熟的DC细胞。

向洗涤后的T75培养瓶中加入30ml AIM-V培养基，加入1500ng的rhSCF、900ng的rhFLT-3L、900ng的TPO、30000U的rhGM-CSF和15000U rhIL-4，置37℃、5% CO₂的二氧化碳培养箱，继续培养贴壁细胞。

当贴壁细胞培养至第6天时，见图1，半量换液，200g离心处理10min，回收移出液中的悬浮细胞，补充20000U rhGM-CSF和10000UrhIL-4，并加入选定的特异性肿瘤抗原肽（肺癌的CEA,CK19抗原）进行负载，置37℃、5% CO₂二氧化碳培养箱中，继续培养。

当贴壁细胞培养至第7天时，加入1000U/ml 的rhTNF-α（人重组肿瘤坏死因子-α）300ul，置37℃、5% CO₂二氧化碳培养箱，继续培养。

贴壁细胞培养至第9天左右时，在显微镜下观察细胞，部分细胞已经开始悬浮在培养液中，细胞长出许多突出的树突，细胞变为毛刺状悬浮细胞，见图2，即得到成熟的DC细胞，终止培养。

将添加诱导因子的脐血组记为A组，未添加诱导因子的脐血组记为B组，按照CD80，CD86，HLA-DR，CD1a⁺细胞标志物比例计数，比较各组DC细胞数量，结果见表1。

表1：各组DC细胞数量表。

从表1中可知：添加了细胞诱导因子的A组所得的DC细胞数量远远大于未添加的B组所得的DC数量，说明所添加的诱导因子成功诱导扩增了由脐血CD34⁺细胞转化成的DC细胞。

步骤6、对悬浮的淋巴细胞进行培养，获得CIK细胞。

将步骤4中的悬浮淋巴细胞200g离心10min，弃上清，用AIM-V培养基调整细胞密度至0.5-2.0×10⁶/ml，接种到培养袋中，加入1000U/ml的IFN-γ300ul（γ干扰素）混匀，置37℃、5.0% CO₂的二氧化碳培养箱培养。

培养24h后，向二氧化碳培养箱培养得到的悬浮培养细胞中，加入2000U/ml的rhIL-2（白介素2）300ul、500U/ml的rhIL-15（白介素15）300ul、50ng/ml的CD3（单克隆抗体）300ul。

根据悬浮细胞培养状态，每2天2倍添加培养液AIM-V培养基, 并补加培养液终体积1%的4000U/mlrhIL-2。

当培养至第7天时，将培养袋内的悬浮细胞转移到WAVE Bioreactor system 10中，继续进行培养8天，获得CIK细胞。显微镜下观察细胞，细胞呈椭圆形，可见小的细胞克隆团，见图3。

步骤7、将DC细胞加入CIK细胞内进行大规模共培养。

将步骤5收集的成熟DC细胞1200r离心处理10min，用AIM-V培养基重悬细胞，加入步骤6中的WAVE Bioreactor system 10中，与悬浮细胞共同培养。逐渐添加AIM-V培养基，并补加培养液终体积1%的4000U/mlrhIL-2和500U/ml rhIL-15。

共同培养至第9天时，见图4，可见较大的细胞克隆团。共同培养至第15天时，培养容器内的细胞可扩增至6×10¹⁰个（50mL的脐带血），1200r离心10min收集共培养的细胞，即为所需的免疫细胞（DC-CIK细胞）。细胞共培养后，DC细胞把T细胞和CIK细胞聚集到周围完成抗原的递呈，见图5，图中可看到明显的两团细胞的聚集，中间为DC细胞。

步骤8、对成熟的DC-CIK细胞进行检测。

同时选取一名肺癌病人，提取其血液进行检测，检测项目包括流式检测、无菌检测、支原体检测和内毒素检测等。进行细胞免疫表型的比较，结果见表2。

表2：细胞免疫表型的比较（%）。

由表2可知：脐带血来源的免疫细胞表面抗原表达率优于病人自体血的免疫细胞表型；脐带血来源的免疫细胞在冻存前后免疫表型基本无变化。

步骤9、检测合格后放入免疫细胞库冻存，并建立细胞档案；所述免疫细胞库是针对不同肿瘤抗原肽的多种效应细胞的集合；该种细胞库的构建即可避免抽血给病人带来的痛苦，又可减少患者因细胞培养增加的住院时间。

将收集的免疫细胞按照0.1-10×10⁸/ml的密度与预冷的细胞冻存液混合，装于细胞冻存管或冻存袋内，附上标签，标签上描述清楚所负载的肿瘤抗原肽种类，经程序降温仪以 -1-3℃/min的速度降温后，转至液氮罐内。

细胞档案详细记录抗原肽负载类型，细胞档案需建立电子版档案和纸质版档案留存查档。

所述细胞冻存液配方为5%的DMSO，10%的羟乙基淀粉，85%稳定剂，配制完成后置于4℃冰箱保存备用。稳定剂为25%人血白蛋白，5%乙二醇，70%培养基。

用于针对DC-CIK的细胞冻存液，通过降低DMSO用量，减轻对免疫细胞的侵袭损害，提高细胞复苏后的质量。冻存液中不同DMSO浓度，在相同冻存时间内，细胞活率的比较结果，见表3。

表3：不同DMSO浓度冻存后的细胞活率比较。

由表3可知：随着冻存液中DMSO浓度的增加，在相同冻存时间内，细胞活率呈明显的下降趋势，因此，在免疫细胞库的建设中，所用冻存液DMSO的浓度越低越有利于保护细胞活率，5%为最佳。

步骤10、根据肺癌患者的临床诊断从免疫细胞库内选择效应细胞，复苏培养24h后回输。

临床诊断肺癌，其常规肿瘤标志物主要包括CEA、CK19，即可从细胞库内提取负载CEA和CK19的效应细胞（DC-CIK细胞）。

用AIM-V培养基重悬复苏后的DC-CIK细胞，并按照4.0-6.0×10⁶/ml的密度接种于细胞培养袋内，按照500U/ml的浓度加入rhIL-2、rhIL-6（白介素6）、rhIL-15，培养24h后，200g离心10min，洗涤，收集免疫细胞进行回输。所述复苏培养过程中，增加了rhIL-6、rhIL-15的使用，促进冻存后细胞亚型的恢复。穿孔素表达水平比较结果，见表4。

表4：穿孔素表达水平比较（%）。

由表4可知：免疫细胞冻存后其分泌穿孔素的量明显下降，但使用本发明实施例1提供的因子组合培养24h后，即可恢复至冻存前水平。