一种基于双席夫碱的荧光传感材料的制备方法和用途与流程

本发明涉及一种荧光化学传感材料的制备方法和用途，特别涉及一种基于双席夫碱的荧光传感材料的制备方法和用途，属于化学荧光传感材料技术领域。

背景技术：

作为环境中主要污染物的重金属离子一直都是人们关注的焦点。随着工业的进步和社会经济的发展，人们对自然界中重金属进行了大肆的开采、冶炼、加工及商业制造，对周围的环境造成了严重的重金属离子污染，严重的影响了生态和人类的健康与安全。煤矿、金属硫化物矿、铁矿及冶金等生产企业往往会产生大量含金属离子的废水，处理不当就会对环境造成严重危害。重金属污染物在自然环境中不能够被微生物降解，一旦进入环境或者生态系统中就会长期存留、蓄积，并且其极易被生物体所吸收，不同形态的重金属离子会通过生物的迁徙，富集等方式作用于动植物，最终通过食物链进入人体危害健康。

作为重金属之一的汞离子具有极强的毒理性，汞对人体的危害主要涉及中枢神经系统、消化系统及肾脏，即使是低水平的暴露也会损害神经系统，表现为精神和行为障碍，能引起感觉异常、共济失调、智能发育迟缓、语言和听觉障碍等。此外汞对呼吸系统、皮肤、血液及眼睛也有一定影响，汞离子可与体内酶或蛋白质中许多带负电的基团如巯基等结合，使细胞内许多代谢途径，如能量的生成、蛋白质和核酸的合成受到影响，从而影响了细胞的功能和生长。此外汞能与细胞膜上的巯基结合，引起细胞膜通透性的改变，导致细胞膜功能的严重障碍。妇孺皆知的“水俣病”的罪魁祸首正是汞离子，2004年 《民主与法制》 报道的四川简阳市简城镇民旺村的饮用水含汞量超标3倍以上，十多年来夺去45条生命，另有20多人因此痴呆变残；汞对人体损害极大，不容小觑。 锌是人体必需的一种微量元素, 它存在于各种基本的生物过程，包括神经信号传导、细胞凋亡、金属酶调控和基因转录等等。锌元素能够参加一些酶的组成和反应，进而通过酶在人体内反应中所起的催化作用对人体机能的各项反应例如生长发育、新陈代谢、组织修复等起着极为重要的作用。尽管如此对于锌的摄入也不可盲目，当锌的含量低于正常水平，会引起皮肤受损、食欲不振、发育阻滞，同时也会抑制蛋白质代谢、改变免疫系统现状、损伤视力等等；同样锌过量也会引起中毒，出现腹痛、便血、肠功能失调、肠坏死或引起溃疡, 严重者甚至会导致胃穿孔引起腹膜炎、休克以及死亡。

为了减少和避免过量汞和锌对生态环境及人类的危害，有效的监测分析是必不可少的，因此开发一种快速、便捷、灵敏有效的检测技术成为了一项新的挑战。荧光传感材料由于其具有高灵敏度，选择性好，易于可视化等优点而备受青睐。该方法避免了传统的检测技术如原子吸收分光光度法，火焰原子化法以及电感耦合等离子体法等严格的预处理的过程，操作简单无需大型的检测仪器，可实现可视化现场检测。近年来用荧光传感材料来检测重金属及过渡金属离子的研究越来越受到关注。荧光传感材料自身具有独特的光学性质，当其结合目标离子时，材料的光物理特性受到影响，荧光信号的输出形式发生改变，基于结合目标离子前后荧光的变化作为响应信号来实现对特定离子的快速检测。

因此，本发明制备了一种基于双席夫碱的荧光响应型传感材料。研究发现该传感材料由于双C=N 基团的存在增强了结合目标离子的能力。氨基硫脲的引入更是增强了传感材料整体的水溶性和生物相容性，可以实现在水溶液介质中对目标离子进行检测应用，也为生物细胞中目标离子的成像分析提供了前提。

技术实现要素：

本发明旨在克服传统检测技术的限制，目的在于提供一种基于双席夫碱衍生物的荧光传感材料及其制备方法和用途，本发明涉及的传感材料能够很好的实现环境水样及生物细胞中痕量Zn²⁺和Hg²⁺的两种重金属离子的有效检测，具有成本低，合成简单，多重响应和检测灵敏度高等特点。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种基于双席夫碱衍生物的荧光传感材料，所述材料是由2, 6-二羟甲基对甲基苯酚和氨基硫脲作为基础原料，活性二氧化锰作为氧化剂，将2, 6-二羟甲基对甲基苯酚氧化成醛，再采用冰乙酸作为催化剂，经亲核反应与氨基硫脲制得荧光传感材料。

本发明还提供一种基于双席夫碱衍生物的荧光传感材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤1. 制备2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚：将2, 6-二羟甲基对甲基苯酚置于圆底烧瓶中，用乙腈将其溶解，65℃油浴锅中搅拌30min后加入活性二氧化锰，高温搅拌回流反应，待反应结束后冷却至室温，过滤除去氧化剂二氧化锰，收集滤液，减压旋蒸移除溶剂得粗产品，在乙醇中重结晶纯化得淡黄色固体。

其中，2, 6-二羟甲基对甲基苯酚的用量为1~3g；乙腈用量为20mL~40mL；活性二氧化锰用量为6~18g；

所述的回流反应温度为110～130℃，反应时间为65～80h。

步骤2. 制备基于双席夫碱的荧光传感材料：将2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚和氨基硫脲置于圆底烧瓶中，用无水乙醇将其溶解，滴加2滴冰乙酸作为催化剂。油浴锅中搅拌回流，待反应结束后冷却至室温，减压旋蒸移除溶剂得粗产品，在正己烷中重结晶纯化得黄色固体。

其中，2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚的用量为0.164～0.492g, 氨基硫脲的用量为0.182～0.546g , 无水乙醇用量为20~40mL，回流反应温度为65～75℃，反应时间为5～7h。

本发明还提供一种基于双席夫碱的荧光传感材料用于环境水样中Zn²⁺和Hg²⁺痕量检测的用途。

本发明还提供一种基于双席夫碱的荧光传感材料用于生物体细胞中Zn²⁺和Hg²⁺的成像分析检测。

本发明与现有技术相比较，有益效果为：

（1）本发明采用2, 6-二羟甲基对甲基苯酚作为基础原料，其具有均匀的对称结构，是制备双席夫碱衍生物的良好选择，其酚羟基上的氧原子也可提供电子作为结合位点。将对称的羟甲基氧化成醛并与两倍的氨基硫脲相结合制备双席夫碱荧光传感材料，对称的双席夫碱结构更加稳定，氨基硫脲具有良好的水溶性，它的引入使得制得的传感材料的水溶性也大大被增强。

（2）制备2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚过程中，采用了活性二氧化锰作为强氧化剂，一步高温回流将羟甲基氧化成醛的制备方法。

（3）制备基于双席夫碱的荧光传感材料过程中，采用冰乙酸作为催化剂大大的缩短了反应时间。

（4）本发明制备的荧光传感材料具有双重响应，分别对重金属Zn²⁺和Hg²⁺具有灵敏的选择性识别性能，表现出不同的荧光发射，响应时间快，在紫外灯下荧光信号的变化肉眼可见，其他常见金属离子干扰性小。

（5）本发明制备的荧光传感材料检测条件更为温和，采用HEPHS缓冲溶剂作为检测介质，避免了大量有机溶剂引入而造成的二次污染。

附图说明

图1为实施例3所制备的基于双席夫碱衍生物的荧光传感材料的合成过程示意图。

图2为实施例3所制备的2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚的¹H NMR图，其中溶剂为CDCl₃。

图3为实施例3所制备荧光传感材料的¹H NMR图，其中溶剂为DMSO-D₆。

图4为实施例3所制备荧光传感材料的¹³C NMR图, 其中溶剂为DMSO-D₆。

图5为实施例3所制备荧光传感材料的MS图。

图6为实施例3所制备荧光传感材料在不同金属离子存在时的荧光光谱图。图中的1表示的是本发明制备的荧光传感材料。

图7为实施例3所制备荧光传感材料在不同浓度Zn²⁺和Hg²⁺存在时的荧光光谱图。

图8为实施例3所制备荧光传感材料的荧光增强程度[I-I₀]与存在的Zn²⁺和Hg²⁺浓度的线性关系图。

图9为实施例3所制备荧光传感材料的 1/[I-I₀]与1/[Zn²⁺]和1/[Hg²⁺]的线性关系图。

图10为实施例3所制备荧光传感材料与Zn²⁺和Hg²⁺离子的Job曲线。

图11为实施例3 所制备荧光传感材料用于生物体活细胞中Zn²⁺和Hg²⁺的成像图；图中a为加入荧光传感材料培养后的细胞在明场下的成像，b为加入荧光传感材料培养后的细胞在荧光场下的成像，c为加入20μM Zn²⁺后细胞在荧光场下的成像，d为加入20μM Hg²⁺后细胞在荧光场下的成像。

图12为实施例3所制备荧光传感材料对实际长江水样中Zn²⁺和Hg²⁺的检测。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明作进一步说明：

实施例1：

步骤1. 制备2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚：将1g 2, 6-二羟甲基对甲基苯酚置于圆底烧瓶中，用20 mL乙腈将其溶解，65℃油浴锅中搅拌30min后加入6g活性二氧化锰， 110℃高温搅拌回流反应65h，待反应结束后冷却至室温，过滤除去氧化剂二氧化锰，收集滤液，减压旋蒸移除溶剂得粗产品，在乙醇中重结晶纯化得淡黄色固体。

步骤2. 制备基于双席夫碱的荧光传感材料：将0.164g的2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚和0.182g的氨基硫脲置于圆底烧瓶中，用20mL无水乙醇将其溶解，滴加2滴冰乙酸作为催化剂。65℃油浴锅中搅拌回流5h，待反应结束后冷却至室温，减压旋蒸移除溶剂得粗产品，在正己烷中重结晶纯化得黄色固体。

实施例2：

步骤1. 制备2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚：将3g 2, 6-二羟甲基对甲基苯酚置于圆底烧瓶中，用40 mL乙腈将其溶解，65℃油浴锅中搅拌30min后加入18g活性二氧化锰， 130℃高温搅拌回流反应80h，待反应结束后冷却至室温，过滤除去氧化剂二氧化锰，收集滤液，减压旋蒸移除溶剂得粗产品，在乙醇中重结晶纯化得淡黄色固体。

步骤2. 制备基于双席夫碱的荧光传感材料：将0.492g的2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚和0.546g的氨基硫脲置于圆底烧瓶中，用40mL无水乙醇将其溶解，滴加2滴冰乙酸作为催化剂。75℃油浴锅中搅拌回流7h，待反应结束后冷却至室温，减压旋蒸移除溶剂得粗产品，在正己烷中重结晶纯化得黄色固体。

实施例3：

步骤1. 制备2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚：将2g 2, 6-二羟甲基对甲基苯酚置于圆底烧瓶中，用30 mL乙腈将其溶解，65℃油浴锅中搅拌30min后加入12g活性二氧化锰， 120℃高温搅拌回流反应72h，待反应结束后冷却至室温，过滤除去氧化剂二氧化锰，收集滤液，减压旋蒸移除溶剂得粗产品，在乙醇中重结晶纯化得淡黄色固体。

步骤2. 制备基于双席夫碱的荧光传感材料：将0.328g的2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚和0.364g的氨基硫脲置于圆底烧瓶中，用30mL无水乙醇将其溶解，滴加2滴冰乙酸作为催化剂。70℃油浴锅中搅拌回流6h，待反应结束后冷却至室温，减压旋蒸移除溶剂得粗产品，在正己烷中重结晶纯化得黄色固体

如图1所示是基于双席夫碱衍生物的荧光传感材料的合成过程示意图。

如图2所示为2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚的 ¹H NMR 图， ¹H NMR (CDCl₃), δ: 2. 33 (s, 3H); 7. 85 (s, 2H); 10. 07 (s, 2H); 11.4(s, 1H)。通过核磁谱图可以确定2, 6-二乙醛-4-甲基苯酚化学结构的正确性。

如图3和图4所示分别是荧光传感材料的¹H NMR和¹³C NMR图。¹H NMR (CDCl₃), δ (ppm): 11.53(s, 2H), 9.57 (s, 1H), 8.33(s, 2H), 8.14 (d, 4H), 8.19 (s, 2H), 7.65 (s, 2H), 2.33(s, 3H)，通过核磁谱图可以确定荧光传感材料的化学结构。

如图5所示为荧光传感材料(C₁₁H₁₄N₆S₂O，M_n=310)的质谱图，其中，333.13为 [M+Na]对应的分子量, 进一步证实了该荧光传感材料的结构。

实施例4：本发明制备的荧光传感材料对Zn²⁺和Hg²⁺检测的特异性验证

将实施例3中制备的荧光传感材料制备成1mM的储备液待用。取1mL上述储备液用HEPES缓冲溶液（0.05M, pH=7.4）定容到100mL配制成10μM荧光传感材料溶液。分别移取4mL上述10μM的待用溶液，分别加入10当量不同种常见的金属离子（Cu²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Pb²⁺, Al³⁺, Sr²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Li²⁺, Cr³⁺, Hg²⁺, K⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, Ca²⁺, Ni²⁺和 Zn²⁺），采用荧光光谱仪分别对各自的荧光光谱进行测定，其中激发波长为390nm。

荧光传感材料自身几乎无荧光发射，当加入10当量不同金属离子后的荧光光谱如图6所示，从图中可以看出，荧光传感材料对Zn²⁺和Hg²⁺表现出独特的选择性，当Zn²⁺和Hg²⁺存在时，在478nm和580nm处分别呈现出强的荧光发射峰，在紫外灯照射下可呈现出肉眼可见的蓝绿色荧光和红色荧光。然而，其他金属离子的存在并没有引起传感材料体系荧光的改变。这个结果表明本发明制备的荧光传感材料对Zn²⁺和Hg²⁺具有双重响应性，可以实现对Zn²⁺和 Hg²⁺的选择性识别检测。

实施例4：本发明制备的荧光传感材料对Zn²⁺和Hg²⁺检测的灵敏性验证

移取实施例3中的10μM的待用溶液，分别对Zn²⁺和Hg²⁺进行荧光和紫外滴定实验，即分别加入0～10当量的Zn²⁺和Hg²⁺进行荧光光谱。本实施例中用到的金属离子浓度分别为：0.1×10^-5M、0.2×10^-5M、0.3×10^-5M、0.4×10^-5M、0.5×10^-5M、0.6×10^-5M、0.7×10^-5M、0.8×10^-5M、0.9×10^-5M、1.0×10^-5M、2.0×10^-5M、3.0×10^-5M、4.0×10^-5M、6.0×10^-5M、8.0×10^-5M、10.0×10^-5M。

荧光滴定实验的荧光发射光谱如图7所示，从图中可以看出，随着金属Zn²⁺浓度的增加，478nm处的荧光发射峰逐渐增强，同样的，Hg²⁺加入量的增加也会引起580nm处的发射峰的增强。

图8表明在一定的浓度范围内相应的荧光增强程度（I-I₀）与金属离子的浓度呈现良好的线性关系，对于Zn²⁺和Hg²⁺，线性方程的斜率（slope）分别为3.61×10⁷和4.78×10⁷，根据方程LOD（L）=3σ/slope（20次空白样的标准偏差σ=1.782和3.985）计算得最低检出限分别可低达1.457×10^-7M和2.50×10^-7M。结果表明该荧光传感材料对一定浓度范围内的Zn²⁺和Hg²⁺可进行定量检测并具有高的灵敏性。

图9为1/[I-I₀]与1/[M](M表示金属离子)之间的线性关系，可以看出两者成线性，根据Benesi-Hildebrand方程（）计算荧光传感材料与Zn²⁺ 和Hg²⁺的结合常数K分别为1.16×10⁴ M^-1和1.13×10⁵ M^-1；其中，I₀表示单独传感材料溶液的荧光强度，I表示加入不同浓度的金属离子后的荧光强度，I_c表示饱和时的荧光强度，K表示传感材料与金属离子之间的结合常数，[M]表示对应的金属离子的浓度。

实施例5：本发明制备的荧光传感材料对Zn²⁺和Hg²⁺结合比例验证

配制10μM的Zn²⁺和Hg²⁺离子溶液，分别将实施例3中配制的10μM荧光传感材料的待用溶液与10μM的金属Zn²⁺和Hg²⁺溶液按不同体积比（0:10～10:0）混合，使得两者混合物的总浓度为10μM，对一系列的混合物进行荧光光谱测定，制备Job曲线确定结合比例。本实施例中用到的体积比分别为：0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0。

图10为荧光传感材料与金属离子的Job曲线，从图中可以看出，当金属离子浓度为体系总浓度一半时，荧光强度达到了最高，这说明荧光传感材料与两种金属离子均以1:1化学计量比进行结合。

实施例6：本发明制备的荧光传感材料对细胞的保护和成像分析

将RAMOS细胞（人B淋巴瘤细胞, 购买于Sigma）在RPMI-1640培养液中培养24h，然后加入 50μM的实施例3制备的荧光传感材料继续培养30min，之后用PBS缓冲溶液洗涤三次移除残余的荧光传感材料，分别加入20μM Zn²⁺和Hg²⁺继续在培养30min，然后再次用PBS洗涤细胞，采用倒置荧光显微镜对加入Zn²⁺和Hg²⁺前后的细胞进行成像分析。

荧光传感材料对生物细胞中Zn²⁺和Hg²⁺的成像结果如图11所示，图11-a和图11-b分别为加入荧光传感材料培养后的细胞在明场和荧光场下的成像，图a表明该传感材料具有低的生理毒性，并没有对生物细胞造成破坏，11-b表明用荧光传感材料培养过的细胞并无荧光；图11-c和图11-d 分别为加入Hg²⁺和Zn²⁺后细胞在荧光场下的成像情况。从图中可以看出，细胞中Zn²⁺和Hg²⁺的存在会引起细胞内部呈现出强的荧光发射。这一结果充分的表明荧光传感材料具有良好的生物膜透过性并已成功进入细胞到内部，同时也证实了荧光传感材料可用于生物体细胞中Zn²⁺和Hg²⁺荧光成像检测分析。

实施例7：本发明制备的荧光传感材料对水样中Zn²⁺和Hg²⁺进行的加标实验

采集长江水水样，对Zn²⁺和Hg²⁺进行的加标实验，取实施例3中的10μM的荧光传感材料的待用溶液，两种金属离子的加标量分别为5μM和10μM，混合均匀后对其荧光光谱进行测定。

荧光传感材料对实际水样中Zn²⁺和Hg²⁺的检测效果如图12所示，从结果可以看出，荧光传感材料对实际水体中的Zn²⁺和Hg²⁺的检测具有很高的灵敏性和很好的选择性，水体中金属离子浓度不同，荧光增强的程度也不同，根据图8荧光增强程度（I-I₀）与Zn²⁺和Hg²⁺浓度之间的线性关系可以实现水体中目标金属离子的定性和定量检测。