CNGC2基因和其编码的氨基酸序列在培育植物新品种中的应用的制作方法

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及CNGC2基因和其编码的氨基酸序列在培育植物新品种中的应用。

背景技术：

Ca是植物生长发育的必需矿质元素。2011年我国生态学家方精云院士领导的科研小组测定了1227种中国植物叶子中11种营养元素的含量，发现Ca的含量为9g/kg，仅次于氮(20g/kg)和钾(10g/kg)，是植物体内第三大矿质元素。对美国不同森林土壤中Ca含量进行长达26,54和74年的测定，发现土壤Ca含量下降50％到78％。土壤中植物可以利用的Ca的流失主要是两个因素造成的：一是酸雨在世界范围内的大量发生，导致大量非游离态Ca溶解在水中成为游离态Ca而流失；二是植物通过根吸收土壤中的Ca，其中的大部分构成了植物细胞壁，被固定在木材及树皮当中，收获农作物、砍伐森林使土壤中的Ca不能被循环利用，从而导致环境中Ca的缺失。植物是吸收土壤Ca的主体。植物Ca营养的两个根本问题是根对Ca营养的吸收和Ca在叶片中的分布。

从全球大趋势而言，酸雨影响使土壤中可利用Ca²⁺量越来越少，这就使植物吸收Ca²⁺能力问题成为了热点话题，但是，目前关于影响植物Ca²⁺分布基因的研究程度还较低，达不到产业应用的水平。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了CNGC2基因和其编码的氨基酸序列在培育植物新品种中的应用。经本申请的发明人研究发现，所述CNGC2基因能够影响植物Ca²⁺分布，促进植物对Ca²⁺的吸收，从而应用于培育植物新品种中。

本发明所采用的技术方案为：一种影响植物Ca²⁺分布的基因，定名为CNGC2基因。所述CNGC2基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

与所述CNGC2基因序列对应的，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本申请的发明人，通过植物生理、细胞和遗传学方法，确定一个编码环核苷酸门控的阳离子通道基因，即CNGC2基因，是调节植物植物叶细胞钙营养的核心基因。所述CNGC2基因在叶子小叶脉末端周边的叶肉细胞内表达，这个位置是木质部中的钙离子释放到叶肉细胞外间隙的位点。缺失所述CNGC2基因的拟南芥突变体在低钙水培条件下可以正常生长，但是在相对高钙环境下，叶子的生长受到显著抑制，同时叶子出现早衰、局部叶肉细胞死亡和光合暗反应受抑制的表型。利用钙离子特异性膜不通透性荧光染料，结合荧光显微镜，本申请的发明人发现，在缺失CNGC2基因的植物叶子内，因为叶肉细胞对钙离子的吸收被阻断，大量钙离子在细胞外积累，说明CNGC2基因编码的蛋白是调节钙离子在植物叶子内正确分布必需的重要因子。

基于以上原理，本发明还公开了所述CNGC2基因和其编码的氨基酸序列在培育植物新品种中的应用。

本发明的有益效果为：本发明提供了CNGC2基因和其编码的氨基酸序列在培育植物新品种中的应用，所述CNGC2基因能够影响植物Ca²⁺分布，促进植物对Ca²⁺的吸收，从而应用于培育植物新品种中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体在含有0.1mM Ca²⁺的水培溶液中培养3个星期，然后水培溶液更换为0.1，1，5或10mM Ca²⁺，继续培养8天后，植物地上部分鲜重的统计分析图；

图2是正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体在含有0.1mM Ca²⁺的水培溶液中培养3个星期，然后水培溶液更换为0.1，1或10mM Ca²⁺，继续培养8天后，叶中的Ca含量的统计分析图；

图3是正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体在含有0.1mM Ca²⁺的水培溶液中培养3个星期，然后水培溶液更换为0.1，1或10mM Ca²⁺，继续培养8天后，根中的Ca含量的统计分析图；

图4是正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体在含有0.1mM Ca²⁺的水培溶液中培养3个星期，然后水培溶液更换为0.1或10mM Ca²⁺，继续培养3天，植物叶子的叶柄插入含有膜不通透性、低亲和性钙离子荧光染料，Oregon Green BAPTA 488 5N(OGB)荧光染料的溶液中，在不同时间点，在蓝色激光条件下，利用荧光显微镜观察依赖钙离子的绿色激发光的分布统计分析图；

图5是正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体在含有0.1mM Ca²⁺的水培溶液中培养3个星期，然后水培溶液更换为0.1或10mM Ca²⁺，继续培养3天，快速收集各处理条件下成熟叶子进行液氮速冻，经过真空冷冻干燥以后，利用偶联X能谱仪场发射扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)测定叶片中表皮毛中的相对Ca含量的统计分析图；

图6是正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体在含有0.1mM Ca²⁺的水培溶液中培养3个星期，然后水培溶液更换为0.1或10mM Ca²⁺，继续培养3天，快速收集各处理条件下成熟叶子进行液氮速冻，经过真空冷冻干燥以后，利用偶联X能谱仪场发射扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)测定叶片中各类细胞中的相对Ca含量的统计分析图；

图中，**表示显著性差异，p<0.01。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范 围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

本实施例为CNGC2基因和其编码的氨基酸序列对植物Ca²⁺分布的影响的验证。

1.实验材料与方法

1.1实验材料

本实施例所用的材料为拟南芥野生型材料和cngc2-1拟南芥突变体，其中cngc2-1拟南芥突变体为不含有CNGC2基因的拟南芥植株，大肠杆菌菌株DH5α和根癌农杆菌菌株GV3101均由市场购得；Primer Star HS DNA Polymerase购自TaKaRa；EasyTaq PCR Supermix DNA聚合酶和T4DNA连接酶购自全式金公司；实验所用MQA药品及浓度为：5mM KNO₃；1mM H₃PO₄；1mM MgSO₄；0.1或10mM CaCl₂；1/2MS微量元素；1/2MS Fe盐；5mM MES；BTP调pH至5.7。

1.2实验方法

1.2.1种子消毒与植株培养

分装适量干燥好的拟南芥种子放于2ml离心管中，向管中加入1.8ml 75％乙醇并放置摇床上摇晃消毒20分钟，然后在超净工作台中弃掉离心管中75％乙醇，倒入100％乙醇摇晃，将种子和乙醇倒在无菌滤纸上晾干，晾干后，用酒精灯火焰烧过的无菌镊子点播在MQA固体培养基上，用医用胶带封皿放于4℃冰箱避光处理3天，最后将培养皿放在培养室培养，光周期为12小时光照/12小时黑暗，光强为75-100μmol m-2 s^-1，培养温度为22-25℃。

1.2.2拟南芥的水培培养

水培体系使用4×8的32孔4ml离心管盒为主要支持物。将同管架大小一 致并预先打孔的黑胶纸贴在离心管盒的管架上，孔大小随苗大小而定，确保幼苗地上部分不可通过即可(一般是0.6mm×0.6mm圆形孔)，盒里加入水培溶液650ml，将培养皿上生长10天的幼苗的根全部放入孔内的溶液中，幼苗地上部分架于溶液上，幼苗全部放好后盖上离心管盒盖，用于保湿。待植株再生长15-25天即可用于实验。

1.2.6荧光染料观察细胞外钙的实验方法

(1)用双面刀片从叶柄基部剪取生长在MQA 0.1mM Ca²⁺水培溶液中的Col-0和cngc2-1拟南芥突变体叶片，将Col-0和cngc2-1叶柄分别插入到含有20μM Oregon Green 488BAPTA-5N(OGB)荧光染料的MQA 0.1mM Ca²⁺和MQA 10mM Ca²⁺溶液中，置于避光盒子内；

(2)在不同时间点将叶片用镊子轻轻取出，放置在30％甘油铺平的载玻片上，轻轻盖上盖玻片，用倒置荧光显微镜观察，Oregon Green 488BAPTA-5N激发光为494nm。采用波长收集范围是460-480nm，发射光收集范围是500-560nm的滤光片进行拍照。

2.实验验证：

2.1缺失CNGC2基因的cngc2-1拟南芥突变体具有高钙离子敏感表型

将种子播种在0.1mM Ca²⁺浓度下的培养皿中，生长21天后，移到0.1mM Ca²⁺水培溶液中生长21天，第22天更换0.1，1，5或10mM Ca²⁺溶液生长8天后采集数据，结果发现缺失CNGC2基因的cngc2-1拟南芥突变体在1mM Ca²⁺浓度下生长矮小，叶片边缘黄化；生长在5，10mM Ca²⁺条件下的cngc2-1拟南芥突变体黄化及矮小现象更严重。对地上部分鲜重进行称量，并对同一个浓度下的Col-0和cngc2-1拟南芥突变体进行统计学分析，结果如图1所示，在0.1mM Ca²⁺浓度下，Col-0和cngc2-1拟南芥突变体鲜重相似，统计学分析没有差异；在1，5，10mM Ca²⁺浓度下的水培体系下生长，cngc2-1拟南芥突变体植株鲜重明显小于Col-0，统计学分析两者具有显著差异(p<0.01)。说明缺失CNGC2基因的cngc2-1拟南芥突变体具有高钙离子敏感表型，所述CNGC2基 因能够影响植物Ca²⁺分布，促进植物对Ca²⁺的吸收，从而应用于培育植物新品种中。

2.2缺失CNGC2基因的cngc2-1拟南芥突变体叶Ca含量显著降低

将正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体在含有0.1mM Ca²⁺的水培条件下培养3个星期，然后分别给予植物0.1，1和10mM Ca²⁺处理，3天以后，利用原子吸收光谱分别测定叶和根的Ca含量，结果如图2和图3所示，图2表示，0.1mM和1mM Ca²⁺浓度下Col-0和cngc2-1拟南芥突变体叶Ca含量没有显著区别，但是在10mM Ca²⁺浓度下，cngc2-1拟南芥突变体叶的Ca含量显著低于Col-0；图3表示，正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体根的Ca含量在三种不同Ca浓度培养条件下都没有区别。这说明，CNGC2基因主要负责植物叶Ca的积累。

2.3高Ca²⁺条件下，Ca²⁺在cngc2-1拟南芥突变体细胞外过量积累

植物根吸收的营养元素通过维管系统向上运输到叶片中，而后将营养物质卸载到质外体空间被叶片不同细胞吸收。Ca²⁺从细胞外空间到叶肉细胞转运的过程，叶肉细胞对Ca²⁺吸收能力的减弱将会导致更多的Ca²⁺积累在细胞外空间。在增加Ca²⁺浓度下cngc2-1拟南芥突变体叶片早衰，可能原因是，叶肉细胞不能吸收Ca²⁺从而导致叶肉细胞Ca²⁺含量低而更多Ca²⁺积累在细胞外空间。为了验证这个假说，本申请的发明人通过与Ca²⁺结合的荧光染料OGB观察细胞外空间Ca²⁺的分布，将离体叶片放入能够染细胞外Ca²⁺且不能跨细胞质膜的Ca²⁺特异性染料Oregon Green BAPTA 488 5N中，激发光波长/发射光波长＝488nm/521nm，结果如图4所示，10mM Ca²⁺浓度下，0分钟时Col-0和cngc2-1拟南芥突变体的叶片均没有检测到荧光，20分钟后能够清晰的看到Col-0和cngc2-1拟南芥突变体的荧光，荧光表达的位置反应Ca²⁺的分布位置。2小时后0.1mM Ca²⁺浓度下，Col-0和cngc2-1拟南芥突变体细胞质外Ca²⁺主要分布在三级叶脉和小叶脉上，4小时后的观察结果更为明显，Col-0和cngc2-1拟南芥突变体荧光位置相似。在Col-0和cngc2-1拟南芥突变体的非叶脉区域没有荧光信 号，说明Ca²⁺从维管束卸载到叶肉细胞是非常精准的过程使得游离于细胞外的Ca²⁺很少。

然而10mM Ca²⁺浓度下，我们观测2小时和4小时处理后的荧光发现，cngc2-1拟南芥突变体叶脉与叶脉周围都有很强的荧光信号值，在小叶脉周围也检测到较多的荧光信号。而Col-0在小叶脉周围没有检测到信号，并且Col-0的荧光区域与非荧光区域有非常明确的界限，而cngc2-1拟南芥突变体中看不到明显的界限。这说明cngc2-1拟南芥突变体非叶脉组织的细胞外空间中积累了更多的Ca²⁺，也说明在Ca²⁺从细胞外空间到叶肉细胞的分布过程中CNGC2基因扮演着重要的角色。

2.4.缺失CNGC2基因导致叶子中的Ca向叶表皮毛积累。

为了研究缺失CNGC2基因以后是否会影响植物叶和根的Ca含量，将正常植物Col-0和cngc2-1拟南芥突变体在含有0.1mM Ca²⁺的水培条件下培养3个星期，然后用含有0.1mM Ca²⁺和10mM Ca²⁺的水培溶液处理三天，剪下叶片，液氮速冻，用冷冻干燥机(EYELA FDU-2110)干燥24小时。用偶联X能谱仪场发射扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)测定叶片中某特定细胞的Ca含量，结果如图5所示，cngc2-1拟南芥突变体叶表皮毛内的Ca含量显著高于正常植物Col-0，这说明，缺失CNGC2基因以后，植物叶细胞吸收Ca的能力下降，更多的Ca积累到了叶表皮毛中。进一步对叶表面其他细胞内Ca含量进行测定，结果如图5所示，在10mM Ca²⁺培养条件下，cngc2-1拟南芥突变体叶子表面如下细胞内的Ca含量显著低于正常植物Col-0:叶表皮毛旁的莲座细胞；叶表皮莲座细胞旁叶肉细胞；独立的叶肉细胞。这进一步证明，CNGC2调控Ca在植物叶片的分布。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古和盛生态科技研究院有限公司

<120> CNGC2基因和其编码的氨基酸序列在培育植物新品种中的应用

<130> 2010

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2181

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

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gaaggagatc ctgtacagag aatgatattc atcatgcgtg gacgagtcaa acgtatacag 1740

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<210> 2

<211> 726

<212> PRT

<213> 未知

<400> 2

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1 5 10 15

Asp Lys Phe Arg Arg Gln Thr Thr Gly Ile Asp Glu Asn Ser Asn Leu

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Gln Ile Asn Gly Gly Asp Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Glu Thr Pro

35 40 45

Val Leu Ser Ser Val Glu Cys Tyr Ala Cys Thr Gln Val Gly Val Pro

50 55 60

Ala Phe His Ser Thr Ser Cys Asp Gln Ala His Ala Pro Glu Trp Arg

65 70 75 80

Ala Ser Ala Gly Ser Ser Leu Val Pro Ile Gln Glu Gly Ser Val Pro

85 90 95

Asn Pro Ala Arg Thr Arg Phe Arg Arg Leu Lys Gly Pro Phe Gly Glu

100 105 110

Val Leu Asp Pro Arg Ser Lys Arg Val Gln Arg Trp Asn Arg Ala Leu

115 120 125

Leu Leu Ala Arg Gly Met Ala Leu Ala Val Asp Pro Leu Phe Phe Tyr

130 135 140

Ala Leu Ser Ile Gly Arg Thr Thr Gly Pro Ala Cys Leu Tyr Met Asp

145 150 155 160

Gly Ala Phe Ala Ala Val Val Thr Val Leu Arg Thr Cys Leu Asp Ala

165 170 175

Val His Leu Trp His Val Trp Leu Gln Phe Arg Leu Ala Tyr Val Ser

180 185 190

Arg Glu Ser Leu Val Val Gly Cys Gly Lys Leu Val Trp Asp Pro Arg

195 200 205

Ala Ile Ala Ser His Tyr Ala Arg Ser Leu Thr Gly Phe Trp Phe Asp

210 215 220

Val Ile Val Ile Leu Pro Val Pro Gln Ala Val Phe Trp Leu Val Val

225 230 235 240

Pro Lys Leu Ile Arg Glu Glu Lys Val Lys Leu Ile Met Thr Ile Leu

245 250 255

Leu Leu Ile Phe Leu Phe Gln Phe Leu Pro Lys Ile Tyr His Cys Ile

260 265 270

Cys Leu Met Arg Arg Met Gln Lys Val Thr Gly Tyr Ile Phe Gly Thr

275 280 285

Ile Trp Trp Gly Phe Ala Leu Asn Leu Ile Ala Tyr Phe Ile Ala Ser

290 295 300

His Val Ala Gly Gly Cys Trp Tyr Val Leu Ala Ile Gln Arg Val Ala

305 310 315 320

Ser Cys Ile Arg Gln Gln Cys Met Arg Thr Gly Asn Cys Asn Leu Ser

325 330 335

Leu Ala Cys Lys Glu Glu Val Cys Tyr Gln Phe Val Ser Pro Thr Ser

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Thr Val Gly Tyr Pro Cys Leu Ser Gly Asn Leu Thr Ser Val Val Asn

355 360 365

Lys Pro Met Cys Leu Asp Ser Asn Gly Pro Phe Arg Tyr Gly Ile Tyr

370 375 380

Arg Trp Ala Leu Pro Val Ile Ser Ser Asn Ser Leu Ala Val Lys Ile

385 390 395 400

Leu Tyr Pro Ile Phe Trp Gly Leu Met Thr Leu Ser Thr Phe Ala Asn

405 410 415

Asp Leu Glu Pro Thr Ser Asn Trp Leu Glu Val Ile Phe Ser Ile Val

420 425 430

Met Val Leu Ser Gly Leu Leu Leu Phe Thr Leu Leu Ile Gly Asn Ile

435 440 445

Gln Val Phe Leu His Ala Val Met Ala Lys Lys Arg Lys Met Gln Ile

450 455 460

Arg Cys Arg Asp Met Glu Trp Trp Met Lys Arg Arg Gln Leu Pro Ser

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Arg Leu Arg Gln Arg Val Arg Arg Phe Glu Arg Gln Arg Trp Asn Ala

485 490 495

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Leu Arg Arg Asp Ile Lys Arg Tyr Leu Cys Phe Asp Leu Ile Asn Lys

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Val Pro Leu Phe Arg Gly Met Asp Asp Leu Ile Leu Asp Asn Ile Cys

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Asp Arg Ala Lys Pro Arg Val Phe Ser Lys Asp Glu Lys Ile Ile Arg

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Glu Gly Asp Pro Val Gln Arg Met Ile Phe Ile Met Arg Gly Arg Val

565 570 575

Lys Arg Ile Gln Ser Leu Ser Lys Gly Val Leu Ala Thr Ser Thr Leu

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Ile Thr Asp His Phe Arg Tyr Lys Phe Ala Asn Glu Arg Leu Lys Arg

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Pro His Asp His Leu Glu

725