一种Cas9表达载体的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体而言，涉及一种可在哺乳动物细胞中稳定表达Cas9基因的DNA载体。

背景技术：

CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于它的两位前辈ZFN系统和TALEN系统，它有着一些无可比拟的优点。首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点，这大大限制了使用范围。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，而不需要向ZFN和TALEN那样借助商业公司的协助完成。由于以上特点，CRISPR-Cas9被评为2013年生物学10大突破之一。

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。目前较为常用的是CRISPR/Cas9系统,该系统由向导RNA和Cas9切割酶组成。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等(Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guided human genome engineering via Cas9.Science.2013)证明CRISPR/Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALENs酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。但是CRISPR/Cas9的瞬时转染存在效率不稳定的问题，而且在功能基因组高通量筛选过程中此问题尤其严重，因而迫切需要开发出一种Cas9的稳定表达载体，实现Cas9的稳定持续表达。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可在哺乳动物细胞中稳定表达Cas9基因的质粒DNA载体。本发明使用内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ三酶切pX330载体得Cas9编码区，在两侧添加合适的酶切位点后，将编码Cas9的CDS序列构建到pUC-EIN载体中，得载体pUC-CIN。使用pUC-CIN载体稳定转染猪细胞系，经单克隆筛选可以获得稳定表达Cas9基因的细胞株，从而达到在哺乳动物细胞中稳定表达Cas9基因的目的。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种Cas9表达载体pUC-CIN,其序列如SEQ ID NO.11所示，由4.3kb的Cas9片段与5.1kb的pUC-EIN载体骨架连接得到，所述pUC-EIN载体的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；

所述5.1kb的pUC-EIN载体骨架由BspTⅠ、BamHⅠ双酶切pUC-EIN载体得到；

所述4.3kb的Cas9片段由BspTⅠ、BamHⅠ双酶切pUC-Cas9载体得到；

所述pUC-Cas9载体是由AgeⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ三酶切pX330载体得4.3kb、2.2kb及2.0kb片段，将4.3kb Cas9片段插入到pUC-GZ载体中得到；

所述pUC-GZ载体由pUC-mIKB载体经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切得2.6kb的载体骨架和1.4kb片段，将2.6kb的载体骨架与47bp的GZ短片段连接所得；

所述pUC-mIKB载体的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

所述GZ短片段的制作过程如下：

a)从上海生工生物工程有限公司订购2条DNA寡核苷酸GZF、GZR，(其序列如SEQ ID NO.3-4所示)如下：

GZF：5'AATTACTTAAGACCGGTGGTACCACTCGTCTCGAGGAATTCGGATCC 3'

GZR：5'AGCTGGATCCGAATTCCTCGAGACGAGTGGTACCACCGGTCTTAAGT 3'

b)将GZF、GZR分别按照10微摩尔/升的浓度稀释，二者等量混合，取50微升置于薄壁PCR管中，按照下述程序孵育：

95℃5分钟，72℃10分钟，置冰上,GZ短片段制作完成。

pUC-CIN载体经酶切及测序验证无误(AflⅡ、EcoRⅠ双酶切，获得4.3kb、3.3kb及1.8kb条带)。

本发明提供的一种Cas9表达载体，稳定转染哺乳动物细胞系，经单克隆筛选可以获得稳定表达Cas9基因的细胞株，可在哺乳动物中稳定表达Cas9基因。

附图说明

图1是Cas9表达载体pUC-CIN构建过程示意图；

图2是pUC-CIN载体酶切鉴定示意图；

图3是Cas9基因表达检测引物设计示意图；

图4是3D4/21单克隆细胞Cas9基因mRNA水平表达检测示意图；

图5是PIEC单克隆细胞Cas9基因mRNA水平表达检测示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中，如无特殊说明，均采用低糖DMEM培养基培养细胞。

pX330载体购自Addgene公司，货号42230。内切酶均购自NEB公司。DNA寡核苷酸均由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例1 Cas9稳定表达载体的构建及鉴定

1.pUC-CIN载体构建

(1)pUC-mIKB载体序列如SEQ ID NO.1所示,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切得2.6kb的载体骨架和1.4kb片段，将2.6kb的载体骨架与47bp的GZ短片段连接，得pUC-GZ。

GZ短片段的制作过程如下：

从上海生工生物工程有限公司订购2条DNA寡核苷酸GZF、GZR(其序列如SEQ ID NO.3-4所示)，序列如下：

GZF：5'AATTACTTAAGACCGGTGGTACCACTCGTCTCGAGGAATTCGGATCC 3'

GZR：5'AGCTGGATCCGAATTCCTCGAGACGAGTGGTACCACCGGTCTTAAGT 3'

将GZF、GZR分别按照10微摩尔/升的浓度稀释，二者等量混合，取50微升置于薄壁PCR管中，按照下述程序孵育：

95℃5分钟，72℃10分钟，置冰上。

GZ短片段制作完成。

(2)AgeⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ三酶切pX330载体得4.3kb、2.2kb及2.0kb片段，将4.3kb的Cas9片段插入到pUC-GZ载体(AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切)中，得pUC-Cas9载体；

(3)BspTⅠ、BamHⅠ双酶切pUC-Cas9载体得4.3kb的Cas9片段，BspTⅠ、BamHⅠ双酶切pUC-EIN载体(DNA序列如SEQ ID NO.2所示)得5.1kb的载体骨架，将4.3kb的Cas9片段与5.1kb的pUC-EIN载体骨架连接,得pUC-CIN载体，其序列如SEQ ID NO.11所示。pUC-CIN载体经酶切及测序验证无误(AflⅡ、EcoRⅠ双酶切，获得4.3kb、3.3kb及1.8kb条带)。pUC-CIN载体构建示意图如图1所示，酶切鉴定结果如图2所示。

2、Cas9基因表达检测引物的设计与合成

由于Cas9基因编码区较大，PCR法检测其全长cDNA的表达存在一定困难。为了较为准确的检测Cas9在mRNA水平的表达，在Cas9编码区上、中、下游分别设计一对引物，Cas9-F1、Cas9-R1；Cas9-F2、Cas9-R2；Cas9-F3、Cas9-R3(其序列如SEQ ID NO.5-10所示)名称及序列如下：Cas9-F1：5'GCAGCCGACAAGAAGTACAG 3'；Cas9-R1：5'TTGGCCATCTCGTTGCTGAA 3'；Cas9-F2：5'CTGGACTCCCGGATGAACAC 3'；Cas9-R2：5'TTCGCCGTTTGTCTCGATCA 3'；Cas9-F3：5'GCAGATTCGCCTGGATGA 3'；Cas9-R3：5'GCAGCACCTTCTCGTTGG 3'。其中Cas9-F1与Cas9-R1组成一对引物，检测上游序列，Cas9-F3与Cas9-R3检测中游序列，Cas9-F2与Cas9-R2检测下游序列(如图3所示)。引物送上海生工生物工程有限公司合成。

实施例2 Cas9稳定表达的猪肺泡巨噬细胞单克隆筛选

将Cas9稳定表达载体pUC-CIN经MluⅠ单酶切线性化，转染所得猪肺泡巨噬细胞系3D4/21，转染48小时后，铺96孔板5个及10cm培养皿10个，添加900微克/毫升G418进行单克隆筛选，获得13个状态较好的单克隆。提取这些单克隆细胞的总RNA，反转录为cDNA，使用前文所设计合成的三对引物(Cas9-F1、Cas9-R1、Cas9-F2、Cas9-R2、Cas9-F3、Cas9-R3)进行PCR检测，将三对引物都呈阳性的单克隆(5、17、27、42号)判定为稳定表达Cas9基因的单克隆细胞株，具体结果如图4所示。

实施例3 Cas9稳定表达的猪血管内皮细胞单克隆筛选

猪血管内皮细胞PIEC复苏后，传代两次，铺24孔板，在其中6孔中使用脂质体(lipo2000)转染pUC-CIN载体(已MluⅠ单酶切线性化)；转染48小时后，铺96孔板4个及10cm培养皿8个，添加800μg/ml G418进行单克隆筛选，获得7个状态较好的单克隆，分别命名为1、2、3、4、5、6、8号。提取这些单克隆细胞的总RNA，反转录为cDNA，使用前文所设计合成的三对引物(Cas9-F1、Cas9-R1、Cas9-F2、Cas9-R2、Cas9-F3、Cas9-R3)进行PCR检测，将三对引物都呈阳性的单克隆(1、2、3、5、6号)判定为稳定表达Cas9基因的单克隆细胞株，具体结果如图5所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛市畜牧兽医研究所

<120> 一种Cas9表达载体

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4034

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt catcgattcc gcctcagaag 420

ccatagagcc caccgcatcc ccagcatgcc tgctattgtc ttcccaatcc tcccccttgc 480

tgtcctgccc caccccaccc cccagaatag aatgacacct actcagacaa tgcgatgcaa 540

tttcctcatt ttattaggaa aggacagtgg gagtggcacc ttccagggtc aaggaaggca 600

cgggggaggg gcaaacaaca gatggctggc aactagaagg cacagtcgag gctgatcagc 660

gggtttaaac tcttttagac actttccaaa gctcataacg tcaggcgctg gcctccaagc 720

acgcagtcgt catagggcag ctcatcctct gtgaactctg actccgtgtc atagctctcc 780

tcatcctcgc tctctggaag catctggagg ttttctaggg tcagctggcc cagctgctgc 840

tgtatccgag tgcttgggcg gccccaggtg agctggtacg gggagtagcc ctggtaggtg 900

actctgttga catcagcccc acacttcaac aagagcgaca ccaggtcggg attctgcagg 960

tccaccgcaa gatgcagggc ggttcggcca ttgcagggct cctgagcgtt gacatcagca 1020

cccaaagaca ccaacagctc cacaatgccc aggtagccat ggatcgaggc taagtgcaga 1080

catgtgtggc cattgtagtt ggtggcctgc agaatggagt ggaggtgctg ggtcccgcgg 1140

ggctgagtca ggactcccac actggccagg cagccctgct cacaggcaag gtgtagaggg 1200

gtatttcctc gaaagtctcg gagctcagga tcacagccag cttccagaag tgcctcagcg 1260

atttctggct ggttggtgat caccgccaag tggagtggag tctgctgcag gttgttctgg 1320

aagttaagaa aagccagatc tcccttcact tggcggacca cttccatggt cagtgccttc 1380

tcttcatgga tgatggccaa gtgcaggaac gagtctccgt cctcggtgag ctgctgcttc 1440

cagggctcgg cgccgcgggg cgcctcctgc ggctcgaggc ggatctcgcg cagctccttc 1500

accatctgct cgtactcctc gtccttcatg gcgtccaggc cggcgtcgtg gcggtcatcc 1560

agtagccgct ccttcttgag cgcgtcccgg ggcccctcca tggcccactc ctggccgggc 1620

tctgcgggct ggaacatggc gcgatgaggg cttgggcgct gctccctagg tgcgcgggcc 1680

acaggctgcg cggcgcgctg gctgctcgcg gtggctcggg cgggcgggac gatggcctcg 1740

gactgttgga tccgataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatgc tagcaagctt 1800

ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 1860

caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 1920

cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 1980

gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 2040

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2100

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2160

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2220

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2280

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2340

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 2400

gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 2460

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 2520

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 2580

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 2640

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 2700

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 2760

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 2820

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 2880

attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 2940

ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 3000

tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 3060

aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 3120

acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 3180

aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 3240

agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 3300

ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 3360

agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 3420

tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 3480

tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 3540

attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 3600

taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 3660

aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 3720

caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 3780

gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 3840

cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 3900

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 3960

acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 4020

gaggcccttt cgtc 4034

<210> 2

<211> 5867

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gcggccgcat taccctgtta 420

tccctagaat tcgatgctga agttcctata gtttctagag tataggaact tcggtcataa 480

cttcgtatag catacattat acgaagttat tccggataag atacattgat gagtttggac 540

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 600

ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttgg ggtgggcgaa gaactccagc 660

atgagatccc cgcgctggag gatcatccag ccggcgtccc ggaaaacgat tccgaagccc 720

aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt gggcgtcgct 780

tggtcggtca tttcgaaccc cagagtcccg ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga 840

aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc 900

attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt 960

ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga 1020

tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg 1080

ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 1140

cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 1200

ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 1260

tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 1320

cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 1380

gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 1440

caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca 1500

cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca 1560

cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc 1620

atgctagctt atcatcgtgt ttttcaaagg aaaaccacgt ccccgtggtt cggggggcct 1680

agacgttttt ttaacctcga ctaaacacat gtaaagcatg tgcaccgagg ccccagatca 1740

gatcccatac aatggggtac cttctgggca tccttcagcc ccttgttgaa tacgcttgag 1800

gagagccatt tgactctttc cacaactatc caactcacaa cgtggcactg gggttgtgcc 1860

gcctttgcag gtgtatctta tacacgtggc ttttggccgc agaggcacct gtcgccaggt 1920

ggggggttcc gctgcctgca aagggtcgct acagacgttg tttgtcttca agaagcttcc 1980

agaggaactg cttccttcac gacattcaac agaccttgca ttcctttggc gagaggggaa 2040

agacccctag gaatgctcgt caagaagaca gggccaggtt tccgggccct cacattgcca 2100

aaagacggca atatggtgga aaataacata tagacaaacg cacaccggcc ttattccaag 2160

cggcttcggc cagtaacgtt aggggggggg ggggagaggg gcggaattgg atccgatatc 2220

ttacttgtac agctcgtcca tgccgagagt gatcccggcg gcggtcacga actccagcag 2280

gaccatgtga tcgcgcttct cgttggggtc tttgctcagg gcggactggg tgctcaggta 2340

gtggttgtcg ggcagcagca cggggccgtc gccgatgggg gtgttctgct ggtagtggtc 2400

ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 2460

gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 2520

gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 2580

cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 2640

gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 2700

cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca ctgcacgccg taggtcaggg tggtcacgag 2760

ggtgggccag ggcacgggca gcttgccggt ggtgcagatg aacttcaggg tcagcttgcc 2820

gtaggtggca tcgccctcgc cctcgccgga cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcgcc 2880

gtccagctcg accaggatgg gcaccacccc ggtgaacagc tcctcgccct tgctcaccat 2940

cttaaggatc tgacggttca ctaaaccagc tctgcttata tagacctccc accgtacacg 3000

cctaccgccc atttgcgtca atggggcgga gttgttacga cattttggaa agtcccgttg 3060

attttggtgc caaaacaaac tcccattgac gtcaatgggg tggagacttg gaaatccccg 3120

tgagtcaaac cgctatccac gcccattgat gtactgccaa aaccgcatca ccatggtaat 3180

agcgatgact aatacgtaga tgtactgcca agtaggaaag tcccataagg tcatgtactg 3240

ggcataatgc caggcgggcc atttaccgtc attgacgtca atagggggcg tacttggcat 3300

atgatacact tgatgtactg ccaagtgggc agtttaccgt aaatactcca cccattgacg 3360

tcaatggaaa gtccctattg gcgttactat gggaacatac gtcattattg acgtcaatgg 3420

gcgggggtcg ttgggcggtc agccaggcgg gccatttacc gtaagttatg taacgcggaa 3480

ctccatatat gggctatgaa ctaatgaccc cgtaattgag atctgaagtt cctatagttt 3540

ctagagtata ggaacttcgg tcataacttc gtatagcata cattatacga agttatacgc 3600

gttttaaacg gccgggccgg ccatgcatag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 3660

tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 3720

taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 3780

cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 3840

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 3900

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 3960

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 4020

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 4080

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 4140

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 4200

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta 4260

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 4320

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 4380

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 4440

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 4500

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 4560

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 4620

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 4680

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 4740

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 4800

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 4860

atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 4920

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 4980

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 5040

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 5100

gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 5160

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 5220

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 5280

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 5340

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 5400

gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 5460

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 5520

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 5580

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 5640

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 5700

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 5760

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat 5820

catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 5867

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aattacttaa gaccggtggt accactcgtc tcgaggaatt cggatcc 47

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agctggatcc gaattcctcg agacgagtgg taccaccggt cttaagt 47

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcagccgaca agaagtacag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttggccatct cgttgctgaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctggactccc ggatgaacac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcgccgttt gtctcgatca 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcagattcgc ctggatga 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcagcacctt ctcgttgg 18

<210> 11

<211> 9431

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gcggccgcat taccctgtta 420

tccctagaat tcgatgctga agttcctata gtttctagag tataggaact tcggtcataa 480

cttcgtatag catacattat acgaagttat tccggataag atacattgat gagtttggac 540

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 600

ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttgg ggtgggcgaa gaactccagc 660

atgagatccc cgcgctggag gatcatccag ccggcgtccc ggaaaacgat tccgaagccc 720

aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt gggcgtcgct 780

tggtcggtca tttcgaaccc cagagtcccg ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga 840

aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc 900

attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt 960

ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga 1020

tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg 1080

ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 1140

cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 1200

ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 1260

tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 1320

cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 1380

gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 1440

caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca 1500

cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca 1560

cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc 1620

atgctagctt atcatcgtgt ttttcaaagg aaaaccacgt ccccgtggtt cggggggcct 1680

agacgttttt ttaacctcga ctaaacacat gtaaagcatg tgcaccgagg ccccagatca 1740

gatcccatac aatggggtac cttctgggca tccttcagcc ccttgttgaa tacgcttgag 1800

gagagccatt tgactctttc cacaactatc caactcacaa cgtggcactg gggttgtgcc 1860

gcctttgcag gtgtatctta tacacgtggc ttttggccgc agaggcacct gtcgccaggt 1920

ggggggttcc gctgcctgca aagggtcgct acagacgttg tttgtcttca agaagcttcc 1980

agaggaactg cttccttcac gacattcaac agaccttgca ttcctttggc gagaggggaa 2040

agacccctag gaatgctcgt caagaagaca gggccaggtt tccgggccct cacattgcca 2100

aaagacggca atatggtgga aaataacata tagacaaacg cacaccggcc ttattccaag 2160

cggcttcggc cagtaacgtt aggggggggg ggggagaggg gcggaattgg atccgaattc 2220

ttactttttc ttttttgcct ggccggcctt tttcgtggcc gccggccttt tgtcgcctcc 2280

cagctgagac aggtcgatcc gtgtctcgta caggccggtg atgctctggt ggatcagggt 2340

ggcgtccagc acctctttgg tgctggtgta cctcttccgg tcgatggtgg tgtcaaagta 2400

cttgaaggcg gcaggggctc ccagattggt cagggtaaac aggtggatga tattctcggc 2460

ctgctctctg atgggcttat cccggtgctt gttgtaggcg gacagcactt tgtccagatt 2520

agcgtcggcc aggatcactc tcttggagaa ctcgctgatc tgctcgatga tctcgtccag 2580

gtagtgcttg tgctgttcca caaacagctg tttctgctca ttatcctcgg gggagccctt 2640

cagcttctca tagtggctgg ccaggtacag gaagttcaca tatttggagg gcagggccag 2700

ttcgtttccc ttctgcagtt cgccggcaga ggccagcatt ctcttccggc cgttttccag 2760

ctcgaacagg gagtacttag gcagcttgat gatcaggtcc tttttcactt ctttgtagcc 2820

cttggcttcc agaaagtcga tgggattctt ctcgaagctg cttctttcca tgatggtgat 2880

ccccagcagc tctttcacac tcttcagttt cttggacttg cccttttcca ctttggccac 2940

caccagcaca gaataggcca cggtggggct gtcgaagccg ccgtacttct tagggtccca 3000

gtccttcttt ctggcgatca gcttatcgct gttcctcttg ggcaggatag actctttgct 3060

gaagccgcct gtctgcacct cggtcttttt cacgatattc acttggggca tgctcagcac 3120

tttccgcacg gtggcaaaat cccggccctt atcccacacg atctccccgg tttcgccgtt 3180

tgtctcgatc agaggccgct tccggatctc gccgttggcc agggtaatct cggtcttgaa 3240

aaagttcatg atgttgctgt agaagaagta cttggcggta gccttgccga tttcctgctc 3300

gctcttggcg atcatcttcc gcacgtcgta caccttgtag tcgccgtaca cgaactcgct 3360

ttccagctta gggtactttt tgatcagggc ggttcccacg acggcgttca ggtaggcgtc 3420

gtgggcgtgg tggtagttgt tgatctcgcg cactttgtaa aactggaaat ccttccggaa 3480

atcggacacc agcttggact tcagggtgat cactttcact tcccggatca gcttgtcatt 3540

ctcgtcgtac ttagtgttca tccgggagtc caggatctgt gccacgtgct ttgtgatctg 3600

ccgggtttcc accagctgtc tcttgatgaa gccggcctta tccagttcgc tcaggccgcc 3660

tctctcggcc ttggtcagat tgtcgaactt tctctgggta atcagcttgg cgttcagcag 3720

ctgccgccag tagttcttca tcttcttcac gacctcttcg gagggcacgt tgtcgctctt 3780

gccccggttc ttgtcgcttc tggtcagcac cttgttgtcg atggagtcgt ccttcagaaa 3840

gctctgaggc acgatatggt ccacatcgta gtcggacagc cggttgatgt ccagttcctg 3900

gtccacgtac atatcccgcc cattctgcag gtagtacagg tacagcttct cgttctgcag 3960

ctgggtgttt tccacggggt gttctttcag gatctggctg cccagctctt tgatgccctc 4020

ttcgatccgc ttcattctct cgcggctgtt cttctgtccc ttctgggtgg tctggttctc 4080

tctggccatt tcgatcacga tgttctcggg cttgtgccgg cccatcactt tcacgagctc 4140

gtccaccacc ttcactgtct gcaggatgcc cttcttaatg gcggggctgc cggccagatt 4200

ggcaatgtgc tcgtgcaggc tatcgccctg gccggacacc tgggctttct ggatgtcctc 4260

tttaaaggtc aggctgtcgt cgtggatcag ctgcatgaag tttctgttgg cgaagccgtc 4320

ggacttcagg aaatccagga ttgtcttgcc ggactgcttg tcccggatgc cgttgatcag 4380

cttccggctc agcctgcccc agccggtgta tctccgccgc ttcagctgct tcatcacttt 4440

gtcgtcgaac aggtgggcat aggttttcag ccgttcctcg atcatctctc tgtcctcaaa 4500

cagtgtcagg gtcagcacga tatcttccag aatgtcctcg ttttcctcat tgtccaggaa 4560

gtccttgtcc ttgataattt tcagcagatc gtggtatgtg cccagggagg cgttgaaccg 4620

atcttccacg ccggagattt ccacggagtc gaagcactcg attttcttga agtagtcctc 4680

tttcagctgc ttcacggtca ctttccggtt ggtcttgaac agcaggtcca cgatggcctt 4740

tttctgctcg ccgctcagga aggcgggctt tctcattccc tcggtcacgt atttcacttt 4800

ggtcagctcg ttatacacgg tgaagtactc gtacagcagg ctgtgcttgg gcagcacctt 4860

ctcgttgggc aggttcttat cgaagttggt catccgctcg atgaagctct gggcggaagc 4920

gcccttgtcc accacttcct cgaagttcca gggggtgatg gtttcctcgc tctttctggt 4980

catccaggcg aatctgctgt ttcccctggc cagagggccc acgtagtagg ggatgcggaa 5040

ggtcaggatc ttctcgatct tttcccggtt gtccttcagg aatgggtaaa aatcttcctg 5100

ccgccgcaga atggcgtgca gctctcccag gtggatctgg tgggggatgc tgccgttgtc 5160

gaaggtccgc tgcttccgca gcaggtcctc tctgttcagc ttcacgagca gttcctcggt 5220

gccgtccatc ttttccagga tgggcttgat gaacttgtag aactcttcct ggctggctcc 5280

gccgtcaatg tagccggcgt agccgttctt gctctggtcg aagaaaatct ctttgtactt 5340

ctcaggcagc tgctgccgca cgagagcttt cagcagggtc aggtcctggt ggtgctcgtc 5400

gtatctcttg atcatagagg cgctcagggg ggccttggtg atctcggtgt tcactctcag 5460

gatgtcgctc agcaggatgg cgtcggacag gttcttggcg gccagaaaca ggtcggcgta 5520

ctggtcgccg atctgggcca gcaggttgtc caggtcgtcg tcgtaggtgt ccttgctcag 5580

ctgcagtttg gcatcctcgg ccaggtcgaa gttgctcttg aagttggggg tcaggcccag 5640

gctcagggca atcaggtttc cgaacaggcc attcttcttc tcgccgggca gctgggcgat 5700

cagattttcc agccgtctgc tcttgctcag tctggcagac aggatggcct tggcgtccac 5760

gccgctggcg ttgatggggt tttcctcgaa cagctggttg taggtctgca ccagctggat 5820

gaacagcttg tccacgtcgc tgttgtcggg gttcaggtcg ccctcgatca ggaagtggcc 5880

ccggaacttg atcatgtggg ccagggccag atagatcagc cgcaggtcgg ccttgtcggt 5940

gctgtccacc agtttctttc tcaggtggta gatggtgggg tacttctcgt ggtaggccac 6000

ctcgtccacg atgttgccga agatggggtg ccgctcgtgc ttcttatcct cttccaccag 6060

gaaggactct tccagtctgt ggaagaagct gtcgtccacc ttggccatct cgttgctgaa 6120

gatctcttgc agatagcaga tccggttctt ccgtctggtg tatcttcttc tggcggttct 6180

cttcagccgg gtggcctcgg ctgtttcgcc gctgtcgaac agcagggctc cgatcaggtt 6240

cttcttgatg ctgtgccggt cggtgttgcc cagcaccttg aatttcttgc tgggcacctt 6300

gtactcgtcg gtgatcacgg cccagcccac agagttggtg ccgatgtcca ggccgatgct 6360

gtacttcttg tcggctgctg ggactccgtg gataccgacc ttccgcttct tctttggggc 6420

catcttatcg tcatcgtctt tgtaatcaat atcatgatcc ttgtagtctc cgtcgtggtc 6480

cttatagtcc atggtggcac cggtcttaag gatctgacgg ttcactaaac cagctctgct 6540

tatatagacc tcccaccgta cacgcctacc gcccatttgc gtcaatgggg cggagttgtt 6600

acgacatttt ggaaagtccc gttgattttg gtgccaaaac aaactcccat tgacgtcaat 6660

ggggtggaga cttggaaatc cccgtgagtc aaaccgctat ccacgcccat tgatgtactg 6720

ccaaaaccgc atcaccatgg taatagcgat gactaatacg tagatgtact gccaagtagg 6780

aaagtcccat aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg ggccatttac cgtcattgac 6840

gtcaataggg ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt actgccaagt gggcagttta 6900

ccgtaaatac tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct attggcgtta ctatgggaac 6960

atacgtcatt attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc ggtcagccag gcgggccatt 7020

taccgtaagt tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta tgaactaatg accccgtaat 7080

tgagatctga agttcctata gtttctagag tataggaact tcggtcataa cttcgtatag 7140

catacattat acgaagttat acgcgtttta aacggccggg ccggccatgc atagcttggc 7200

gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa 7260

catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac 7320

attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 7380

ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 7440

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 7500

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 7560

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 7620

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 7680

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 7740

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 7800

ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 7860

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 7920

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 7980

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 8040

ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 8100

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 8160

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 8220

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 8280

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 8340

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 8400

ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 8460

tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 8520

ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 8580

tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 8640

aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt 8700

gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 8760

tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 8820

cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 8880

tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 8940

ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac 9000

cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 9060

actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 9120

ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 9180

aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 9240

ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 9300

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 9360

tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag 9420

gccctttcgt c 9431