一种稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记及其应用的制作方法

本发明属于农作物分子育种领域，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记及其应用。

背景技术：
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我国是世界上年产稻谷最多的国家，水稻产量的稳定性直接关系到国计民生。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，被称为水稻的癌症。目前，发掘和利用广谱稻瘟病抗性基因来培育抗病的水稻品种是控制稻瘟病的主要措施。传统的水稻抗病育种依赖于人工接种和植株表型的选择，费时费力，并且受到病菌菌株和病菌发病条件等的影响，选育效率较低。而利用与目的基因紧密连锁的分子标记虽然大大提高了育种效率，但应用过程中也存在受到遗传背景以及遗传重组的限制，最终辅助选择失败。因此，直接对稻瘟病抗性基因进行选择，是最有效的抗性鉴定方法。其中，利用稻瘟病抗病基因序列，建立与抗病基因完全共分离的特异性标签，可达到100％选择的准确性。此外，通过鉴定抗病基因及其等位基因在功能区域的特异性保守序列，进而建立抗病基因及其等位基因在功能区域的特异性标签，有助于鉴定杂交后代的纯杂合基因型，即便扩大选育亲本的范围也同样适用，大大加速了育种的进程。

目前在水稻第6染色体短臂端的Pi2/9基因簇内，至少有10个稻瘟病抗性基因(Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi25,Pi26,Pi50,Pi2-2)定位其中。其中Pi2是一个广谱抗性基因，在稻瘟病抗性育种方面具有重要的应用价值(Jiang et al.2012)。Pi2、Pi9以及Piz-t已经被成功克隆，彼此之间在核苷酸水平上的一致性范围为71.8％～98.6％(Qu et al.2006,Zhou et al.2006)。目前，跟踪抗稻瘟病基因Pi2的分子标记一般用紧密连锁的SSR标记如AP22，距离Pi2均有一定的距离，选择效率无法达到100％，也无法直接用来检测水稻样品中是否含有Pi2基因。利用Pi2的基因序列与日本晴等位基因的序列差异，建立了Pi2基因的共显性分子标记M-Pi2，此标记虽然可以鉴定Pi2，但是无法区分Pi2和Piz-t，并且无法鉴定出纯杂合基因型(Gao et al.2010)。基于Pi2基因序列单碱基差异得到的分子标记，通过PCR扩增得到的产物，经Pst I或Hinf I酶切后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，可特异地鉴定出Pi2(Hua et al.2015,Tian et al.2016)，但此方法步骤较为繁琐，在进行产业化分子育种过程中，需耗费较多的时间和费用。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种能够适用于Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分离群体的分子标记辅助选择，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求，特异性高，可以快速鉴定后代分离群体的纯杂合基因型的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记。

本发明的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记，其特征在于，包括以下引物：

2Pi2-F：5’-GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG-3’，其序列如SEQ ID NO.1所示；

2Pi2-R：5’-AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT-3’，其序列如SEQ ID NO.2所示；

2WT-R：5’-AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC-3’，其序列如SEQ ID NO.3所示或2WT-1R：5’-AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC-3’，其序列如SEQ ID NO.4所示。

即包括2Pi2-F、2Pi2-R和2WT-R；或者2Pi2-F、2Pi2-R和2WT-1R。

本发明的第二个目的是提供一种检测是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及是纯、杂合基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待测水稻基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，分别用上述引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，或者，分别用上述引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-1R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，对应下表即可判断待测水稻基因组中是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及待测水稻的稻瘟病抗性基因Pi2纯、杂合基因型；

也就是说提取待测水稻基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，先用2Pi2-F/2Pi2-R进行扩增，如果得到416bp的产物，那么待测水稻含有稻瘟病抗性基因Pi2；然后以该基因组DNA作为模板，分别用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，如果没有PCR扩增产物，那么该待测水稻就是Pi2纯合型；如果扩增得到416bp(对应引物对2Pi2-F/2WT-R)或419bp(对应引物对2Pi2-F/2WT-1R)的扩增产物，那么该待测水稻就是Pi2杂合型；

用2Pi2-F/2Pi2-R进行扩增，如果不能得到416bp的产物，那么待测水稻不含有稻瘟病抗性基因Pi2；然后以该基因组DNA作为模板，分别用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，扩增得到416bp(对应引物对2Pi2-F/2WT-R)或419bp(对应引物对2Pi2-F/2WT-1R)的扩增产物，该待测水稻就是Pi2的等位基因纯合型。

优选，所述的PCR，其反应体系为：DNA模板1.0μL、10μM 2Pi2-F 0.5μL、10μM 2Pi2-R或2WT-R 0.5μL、2×Taq PCR Master Mix 5μL，其余由双蒸灭菌水补足至10μL，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共运行35个循环；72℃延伸5min。

本发明的第三个目的是提供上述稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记在判断待测水稻基因组中是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及待测水稻的稻瘟病抗性基因Pi2纯、杂合基因型中的应用。

本发明具有如下明显的有益效果：

(1)本发明简便快速、成本低廉，适用于Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分离群体的分子标记辅助选择，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。

(2)本发明提供的分子标记特异性高：通过比对Pi2及其等位基因在多个品种中功能LRR区域的保守性和特异性，同时结合已报导的Pi2与Pi9、Piz-t以及其余21个品种在该LRR区域的保守性和特异性(Tian et al.2016)，开发的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R(或者2Pi2-F/2WT-1R)引物对可以特异性的扩增Pi2和其等位基因。

(3)本发明提供的分子标记可以快速鉴定后代分离群体的纯杂合基因型，对于加速育种进程有着重要的作用。

(4)本发明是在Pi2基因内部的功能LRR区域序列，并且是测定了多个品种后开发的分子标记，因此，即便扩大亲本选育范围，此方法仍然适用。

附图说明

图1为本发明实施例1中对多个水稻品种的Pi2及其等位基因在LRR区域的序列对比图；其中，左边为对应的水稻品种名称，右边为测序序列；虚线框内(下横线所对应部分)表示Pi2基因与所测序品种在LRR区域特异性的保守序列。

图2为本发明实施例1中BL122-Pi2杂合体在该区域序列的测序峰图；其中，箭头表示在该位点核苷酸的测序结果为双峰。

图3为本发明实施例1中例举的已经公开发表的Pi2与Pi9、Piz-t以及其余21个品种在Pi2的LRR区域的核苷酸序列对比图(Tian et al.2016)；虚线框内(下横线所对应部分)表示Pi2基因与所测序品种在LRR区域特异性的保守序列。

图4为本发明实施例2中利用分子标记2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R鉴定11个水稻品种Pi2基因型的电泳图；其中，1～11对应的水稻品种分别为：广青占、丰澳占、泰小占、奇国占、金科占、IR24、增城丝苗、金农丝苗、明恢70、BL122-Pi2杂合和BL122-Pi2纯合。

图5为本发明实施例3中利用SSR标记AP22、分子标记2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R检测Pi2在4个亲本之间的多态性的电泳图；

图6为本发明实施例3中利用分子标记2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R检测(BL122/植B)/(CBB23/植B)以及(BL122/祥B)/(CBB23/祥B)杂交后代的电泳图；1～33分别对应于杂交后代各单株，其中K代表抗病单株，G代表感病单株。

图7是本发明实施例4中2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R引物对的灵敏度实验结果的电泳图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1水稻Pi2基因功能性标记2Pi2-F和2Pi2-R、2WT-R/2WT-1R的引物设计及扩增片段分析

1、引物设计

通过水稻数据库(http://www.gramene.org/)及常规PCR法扩增并测序获得多个水稻品种的Pi2及其等位基因在抗稻瘟病的功能LRR(Leucine-Rich Repeats)区域特异性的保守序列，如图1所示的虚线框内；图2为BL122-Pi2杂合体在该区域序列的测序峰图，可知Pi2与其等位基因在此区域保守差异的核苷酸的测序结果都为双峰；图3为已经公开发表的Pi2与Pi9、Piz-t以及其余21个品种在该区域的核苷酸序列对比(Tian et al.2016)。综合可知，Pi2在该区域的保守序列为：AGGAATCTCAGATGG中；Pi2等位基因在该区域的保守序列为：GTTATTATCAGATAT或者GTTATTCTCAGGTATTAT。

由此而设计引物序列(5’-3’)如下：

2Pi2-F：5’-GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG-3’；

2Pi2-R：5’-AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT-3’；

2WT-R：5’-AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC-3’；

2WT-1R：5’-AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC-3’。

(引物序列中带下划线的为Pi2及其等位基因的特异碱基)，将这四条引物命名为：稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记。

2、扩增片段分析

利用2Pi2-F/2Pi2-R引物对即可检测待测样品是否含有Pi2基因，进一步利用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R即可检测待测样品的纯杂合，具体分析结果见表1。

表1

实施例2利用水稻Pi2基因功能性标记对9个水稻资源的Pi2进行鉴定

1、水稻基因组DNA的提取

以11个水稻品种为材料：广青占、丰澳占、泰小占、奇国占、金科占、IR24、增城丝苗、金农丝苗、明恢70、BL122-Pi2杂合和BL122-Pi2纯合，依次编号为1～11。采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：(1)将少量水稻新鲜叶片放入预冷的离心管中，加入液氮打磨成粉状；(2)加入600μL的65℃预热CTAB裂解缓冲液，涡旋混匀后于65℃水浴锅中加热45min；(3)加入600μL的氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)混合液，翻转混匀，8,000rpm离心10min；(4)将上清转入新的离心管中，加等0.6倍体积的异丙醇，翻转混匀，静置30min，8,000rpm，离心10min；(5)弃上清，加入1mL的70％的乙醇洗涤，倒掉上清液，通风干燥20min后加入40μL双蒸灭菌水(ddH₂O)，37℃放置1h溶解DNA；随后保存于-20℃。

2、稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记扩增鉴定11个水稻品种Pi2的基因型

利用稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记对11个水稻品种的DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为：DNA模板1.0μL、引物(10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2Pi2-R 0.5μL；或者10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2WT-R 0.5μL)、2×Taq PCR Master Mix 5μL，其余由双蒸灭菌水(ddH₂O)补足至10μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共运行35个循环；72℃延伸5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

3、11个水稻品种Pi2的基因型分析

如图4所示，1～9的水稻品种都只用2Pi2-F/2WT-R标记扩增出条带，说明都不含有稻瘟病抗性基因Pi2(以下简称Pi2)，且都为Pi2等位基因的纯合体；10为Pi2的杂合体，用2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R都扩增得到条带；11为Pi2的纯合体，只用2Pi2-F/2Pi2-R标记扩增出条带。这与11个水稻品种的实际情况相符合。

实施例3杂交组合病圃鉴定与Pi2的特异性分子标记检测的相关性分析

1、实验材料及来源

以BL122(Pi2供体)同植B和祥B分别杂交，记为杂交组合①和②；以CBB23同植B和祥B分别杂交，记为杂交组合③和①和③(②和)的杂交后代在F3代杂交，杂交种自交2代后，在F3代进行稻瘟病抗性鉴定。

2、稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记在4个亲本之间的多态性

利用已报导的SSR引物AP22和本发明中的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记对4个亲本进行鉴定，每个亲本的PCR反应体系为：DNA模板1.0μL、引物(10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2Pi2-R 0.5μL；或者10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2WT-R 0.5μL；或者SSR引物AP22的正、反向引物10μM各0.5μL)、2×Taq PCR Master Mix 5μL，其余由双蒸灭菌水(ddH₂O)补足至10μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共运行35个循环；72℃延伸5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图5所示，AP22虽然可以鉴定出Pi2杂合的基因型，但是很难区分Pi2纯合基因型与3个亲本之间的多态性，并且PCR产物片段较小，需用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测；而利用2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R可以快速鉴定出4个亲本的基因型。其中，植B、祥B、CBB23都为Pi2的等位基因的纯合体，同时可以区分出BL122-Pi2杂合和BL122-Pi2纯合，并且PCR产物较大，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测即可。

3、病圃抗性鉴定及分子标记检测

将F2代杂交种和4个亲本种植于广东省河源市龙川县病圃基地，选取不同群体33份单株做为研究材料，对材料叶瘟和穗瘟进行感抗病鉴定。结果表明，亲本BL122表现为抗，植B、祥B和CBB23表现为中感；在用于研究的33份单株材料里，抗病单株共25个，感病单株8个。对这33份材料进行Pi2检测，发现抗病的25个单株都含有稻瘟病抗性基因Pi2，感病的8个单株都不含有Pi2，如图6。

以上结果表明，稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记检测与稻瘟病病圃鉴定结果完全一致，表明提供的分子标记可以有效地鉴定待测材料是否携带Pi2抗稻瘟病基因，从而准确应用于分子育种。

实施例4：2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R引物对的灵敏度实验

以BL122-Pi2杂合的基因组DNA作为DNA模板进行PCR反应，反应体系为：DNA模板1.0μL、引物(10μM 2Pi2-F 0.5μL和10μM 2Pi2-R 0.5μL；或10μM 2Pi2-F 0.5μL和2WT-R 0.5μL)、2×Taq PCR Master Mix 5μL，其余由双蒸灭菌水补足至10μL，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共运行35个循环；72℃延伸5min。

结果如图7所示，1～12对应的DNA模板浓度分别为：500ng/μL，200ng/μL，100ng/μL，50ng/μL，20ng/μL，10ng/μL，5.0ng/μL，2.0ng/μL，1.0ng/μL，0.5ng/μL，0.2ng/μL，0.1ng/μL；可知，在含有模板量1.0ng的上述PCR反应中，2对引物都已经可以很好地扩增到目的条带。

序列表

<110>中国科学院华南植物园

<120>一种稻瘟病抗性基因 Pi2 的功能性分子标记及其应用

<160>4

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GACAGTTTCA TTATGACAAC TTTAG 25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

AAGTGTTCCA CCATCTGAGA TTCCT 25

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

AAGTGTTCCA ATATCTGATA ATAAC 25

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

AAGTGTTCCA ATAATACCTG AGAATAAC 28