检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物、探针和试剂盒的制作方法

本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物、探针和试剂盒。

背景技术：

华法林是目前临床上广泛使用的香豆素类口服抗凝药，已被应用于多种疾病的抗凝治疗，如静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等，但临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，尤其是在使用华法林抗凝治疗初期，极易导致严重的出血并发症。据估计，服用华法林的患者中，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5％，不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。大量研究表明，华法林代谢酶CYP2C9基因和靶点基因VKORC1基因遗传多态性与其抗凝疗效密切相关，不同基因型患者所需华法林剂量差异明显。

CYP2C9基因位于染色体的10q24.2区域，长约55kb，其最常见的等位基因被命名为CYP2C9*1(野生型)。目前大约有24个CYP2C9的非同义变异体已经被识别，其中对CYP2C9*2和CYP2C9*3(分别对应CYP2C9基因430C>T和1075A>C)的功能研究最为深入，CYP2C9*2蛋白的最大代谢率大约是野生型蛋白的50％，该变异蛋白对华法林的转换率下降30％至50％。CYP2C9*3蛋白具有明显升高的Km值和较低的内在清除率，可使S-华法林7-羟基化作用减少大约90％。分析表明，携带CYP2C9*2或CYP2C9*3变异型的患者需要相对较低的华法林维持剂量，对于携带CYP2C9*3基因型的患者，华法林治疗剂量的减少更为显著(剂量减少30％)，出血副反应在携带CYP2C9*2和(或)CYP2C9*3等位基因的患者中几乎加倍。

VKORC1是华法林的作用靶酶VKOR的编码基因，位于染色体16p11.2，长约4kb。VKORC1的多个遗传多态性位点也被证实与华法林的治疗剂量相关，位于启动子区的-1639G>A(rs9923231)，内含子1的1173C>T(rs9934438)和3c-未翻译区的3730G>A(rs7294)，均被证实会对华法林剂量的个体差异产生影响。其中-1639G>A是目前研究的主要位点，突变型VKORC1基因转录活性下降，对华法林抵抗能力下降，-1639GG基因型对华法林的需求较-1639AA基因型高，同时研究表明该位点多态性存在民族差异，是影响华法林需求剂量中民族差异的主要因素。

目前，针对CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的方法有多种，主要包括DNA测序法、限制性片段长度多态性分析法(PCR-PFLP)、高分辨率溶解曲线法(HRM)和基因芯片法(Genechips)等。DNA测序法是检测金标准，但其对技术要求高、易污染以及结果判读耗时费力。PCR-PFLP步骤冗杂，灵敏度低。HRM简单快速，但是不能检测出纯合突变，容易产生假阳性和假阴性。Genechips所需设备贵重，芯片造价高，难以普及。因此需要建立一种操作方便快速，特异性好，灵敏度高的基因检测方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一组特异型号，灵敏度高的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物和探针，本发明还提供了包括该引物和探针的试剂盒，以及该试剂盒的使用方法。

本发明经过大量试验、研究和分析成功研究出能够用于快速、灵敏、有效的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性检测引物和探针。利用这组引物和探针可以检测出CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1三个位点的基因多态性情况。

本发明提供的一组检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物和探针，包括以下核苷酸序列：

(1)检测CYP2C9*2多态性的突变型上游引物、野生型上游引物以及公用的下游引物和探针：

CYP2C9*2野生型ARMS上游引物：

5’-GGGGAAGACGAGCATTGAGGAAC-3’(SEQ ID NO.1)，

CYP2C9*2突变型ARMS上游引物：

5’-ATGAGGAAGAGGAGCATTGAGGATT-3’(SEQ ID NO.2)，

CYP2C9*2公用的下游引物：

5’-GGTCACCCACCCTTGGTTTTTCT-3’(SEQ ID NO.3)，

CYP2C9*2公用的探针：

5’-FAM/CAAGAGGAAGCCCGC/MGB-3’(SEQ ID NO.4)；

(2)检测CYP2C9*3多态性的突变型上游引物、野生型上游引物以及公用的下游引物和探针：

CYP2C9*3野生型ARMS上游引物：5’-GCACGATGTCCAGAGATAGA-3’(SEQ ID NO.5)，

CYP2C9*3突变型ARMS上游引物：5’-GCACGATGTCCAGAGATAGC-3’(SEQ ID NO.6)，

CYP2C9*3公用的下游引物：5’-CTTACCTTGGGAATGAGATAGT-3’(SEQ ID NO.7)，

CYP2C9*3公用的探针：5’-FAM/ACCAGCCTGCCCCAT/MGB-3’(SEQ ID NO.8)；

(3)检测VKORC1基因-G1639A多态性的突变型上游引物、野生型上游引物以及公用的下游引物和探针：

VKORC1位点野生型ARMS上游引物：

5’-TAGACGTGAGCCACCGCAACC-3’(SEQ ID NO.9)，

VKORC1位点突变型ARMS上游引物：

5’-TAGGCGTGAGCCACCGCAACT-3’(SEQ ID NO.10)，

VKORC1位点公用的下游引物：

5’-GGGAAATATCACAGACGCCAGAGGA-3’(SEQ ID NO.11)，

VKORC1位点公用的探针：

5’-FAM/ATCCCTTACTGTTGCAC/MGB-3’(SEQ ID NO.12)；

所述探针均为MGB探针，探针核苷酸序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

本发明提供的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，包括以上所述的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物和探针。

优选地，上述检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，还包括内控引物对及内控探针，所述内控探针为Taqman探针，探针核苷酸序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；

内控上游引物：5’-GCCAAGGCTGTGGGCAAGGTC-3’(SEQ ID NO.13)，

内控下游引物：5’-CGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’(SEQ ID NO.14)，

内控探针：5’-JOE-CCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.15)。

优选地，上述检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，还包括阳性对照，所述阳性对照为含有CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1基因三个SNP的6种质粒及内控质粒；所述内控质粒含有内控基因。

优选地，上述检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，还包括Fast master Premix。

Fast masterPremix为ABI公司的产品(即美国应用生物系统公司Applied Biosystems)的产品，其将NDA聚合酶与PCR缓冲液集成在一起。有利于使荧光定量PCR时Ct值提前，检测结果更易判断。

本发明提供的以上任一所述的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒的使用方法，包括：

(1)用内控引物及内控Taqman探针扩增阳性对照品，结果显示JOE信号CT值小于25，表示试剂盒可用；

(2)将待检样品DNA分别用每个基因的突变型引物和探针，以及野生型引物和探针进行荧光定量PCR反应并获得对应的突变型CT值和野生型CT值，该基因突变型CT值-野生型CT值＝△Ct，△Ct＞2.5为该基因的纯野生型，△Ct＜-2.5为该基因的纯突变型，-2.5≤△Ct≤2.5为该基因的杂合型。

本发明涉及的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的荧光定量PCR方法不包括对待测样品处理和模板提取的步骤，但对EDTA抗凝血和口腔拭子提取的基因组DNA以及全血细胞去红细胞后的白细胞都具有检测能力。

与现有技术相比，本发明运用ARMS引物区分野生型和突变型基因，有如下有益效果和显著进步：

(1)灵敏度高，可以准确检出低至1ng的基因组DNA。对于保存时间过长以及口腔拭子这些提取浓度很低的样本能准确检出；

(2)特异性强，对于高至500ng及以上的基因组DNA不会出现非特异性的结果。可以减少稀释样本的过程，提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现非特异性；

(3)适用于多种样本类型：本发明不仅能检测常规的EDTA抗凝的全血细胞DNA，还能检测提取质量差的口腔拭子，还可以直接检测全血细胞裂解红细胞后的白细胞，检测结果准确度高。

(3)成本低，ARMS分型法相对于Taqman探针分型法，不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性，而且还能节约成本，ARMS引物合成快速简单，合成成本低，扩增效果更佳。

(4)检测速度快，整个检测过程只需要90分钟。

(5)应用Fast premix预混在反应体系中，减少了酶与样本混合的步骤，减少了样本的污染，操作更简单，一步加样，避免了气溶胶污染引起的假阳性。

(6)安全：整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。

总之，本发明涉及的CYP2C9和VKORC1基因多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。

附图说明

图1是实施例2中样本1的CYP2C9*2CC基因型的检测结果；

图2是实施例2中样本1的CYP2C9*3CC基因型的检测结果；

图3是实施例2中样本1的VKORC1GA基因型的检测结果；

图4是实施例2中样本2的CYP2C9*2TT基因型的检测结果；

图5是实施例2中样本2的CYP2C9*3CC基因型的检测结果；

图6是实施例2中样本2的VKORC1GG基因型的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

以下实施例中所使用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1试剂盒组成

本发明所述的检测试剂盒组成列举以下两种，分别见表1和表2。

表1试剂盒组成一

表2试剂盒组成二

Fast masterPremix为ABI公司的产品(即美国应用生物系统公司Applied Biosystems)的产品，其将NDA聚合酶与PCR缓冲液集成在一起。有利于使荧光定量PCR时Ct值提前，检测结果更易判断。

实施例2：临床样本DNA的提取

一、EDTA抗凝血

本实验部分是从EDTA抗凝血中提取基因组DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用天根公司的血液基因组DNA提取试剂盒，具体详述如下。

1.处理血液材料：

a.当血液样品体积小于200μL时，可加缓冲液GS补足体积至200μL，再进行下一步实验(如血液样品体积为200μL，可直接进行下一步实验，不需加入GS)。

b.当血液样品体积超过200μL时，需用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1～2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS，振荡至彻底混匀。

2.加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

3.加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮，

4.加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9. 12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

11.定量

将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。二、口腔拭子样本

本实验部分是从口腔拭子中提取基因组DNA,并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用康为世纪的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，具体详述如下。

1.将口腔拭子的棉签用剪刀从杆上剪下，置于2ml的离心管(自备)中，加入400μL Buffer GR。

注意：如需无RNA污染的基因组DNA，可加入4μL浓度为100mg/ml的RNase A溶液(货号：CW0601)，震荡混匀。

2.加入20μL Proteinase K和400μL Buffer GL，立即涡旋震荡15秒，充分混匀。

注意：加入Buffer GL后立即充分混匀；不可将Proteinase K直接加入Buffer GL中使用。

3. 56℃放置10分钟，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

4.加入400μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

5.将上步所得溶液和沉淀分两次加入到已装入收集管(Collection Tube2ml)的吸附柱(Spin Column DS)中，一次最多不超过700μL。12,000rpm(～13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。

8. 12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

9.将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50μL Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存。

10.定量

将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。

实施例3：实时荧光PCR法扩增临床样本DNA

本实施例为采用本发明所提供的引物、探针扩增实施例2所提取的DNA样品。

荧光定量PCR反应体系为：

PCR反应液：

MgCl₂：2.0～5.0mmol，

dNTP：0.2～0.8mmol，

各条引物：0.1～1.0μmol，

各条探针：0.1～1.0μmol，

Fast master premix：6～10μL或热启动酶0.3～0.6μL，

模板：10μL，

总体积：40μL。

检测方法如下：

1)每次PCR反应中，同时进行非模板对照(No Template Control；NTC)、阳性对照和待测样本的检测。

2)将阳性对照取出解冻后震荡混匀，并离心30s。

3)将6联PCR反应条取出解冻后离心30s，防止反应液在开盖时溅出。

4)将ddH₂O(NTC)、实施例2中提取的DNA样本、阳性对照分别加入6联PCR反应条，每孔10μL。

5)将以上6联PCR反应条盖好管盖于离心机上离心30S，确保管壁上不沾有液滴。

6)将6联PCR反应条放于实时PCR仪器中。

反应条件的设置：

第一阶段：95℃4min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段：95℃5s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

信号收集：第三阶段72℃时收集FAM和JOE信号。

利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测体系是否正常，样本是否漏加及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值(Ct值小于25)；FAM是检测信号，用于检测样本的基因多态性；在内控信号达到要求后，以每个SNP位点的突变型和野生型FAM信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值作为判断标准。选择1、2号管，根据FAM信号△Ct值判断检测样本CYP2C9*2的等位基因型多态性；选择3、4号管，根据FAM信号△Ct值判断检测样本CYP2C9*3的等位基因型多态性；选择5、6号管，根据FAM信号△Ct值判断检测样本VKORC1的基因多态性，根据表3进行结果判定：

表3基因多态性检测结果判定

其中，样本列中，①～⑥分别指其对应的管号经过荧光定量PCR获得的Ct值。

表4样本检测结果

说明：EDTA抗凝血提取的基因组DNA和口腔拭子提取的基因组DNA用本发明的试剂盒检测的结果和“金标准”sanger测序的结果完全一致，试剂盒准确度高，适应样本广。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉海吉力生物科技有限公司

<120> 检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物、探针和试剂盒

<130> WH1610028-1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggggaagacg agcattgagg aac 23

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaggaaga ggagcattga ggatt 25

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<211> 23

<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atcccttact gttgcac 17

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<212> DNA

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<212> DNA

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cgcctgcttc accaccttct tg 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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