双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针及其合成方法和应用与流程

本发明属于蛋白质检测技术领域，涉及一种在水相中测定蛋白质的荧光探针及其合成方法和检测方法，具体涉及一种双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术：

蛋白质是一类重要的生物大分子，是生命活动的物质基础，是构成生物体内一切组织的基础物质，约占人体的18％，具有修补组织、维持机体正常新陈代谢及各类物质在体内的输送等诸多功能，与各种形式的生命活动有着密切的联系，在生物体内具有特殊的地位。因此，对蛋白质的特异性识别和定量分析有助于推动蛋白质组学、药物诊断以及病原检测等方面的发展，这对于人类探索生命奥秘起着重要的作用。

定量分析痕量蛋白质的方法有分光光度法、荧光光度法、共振瑞利散射光谱法、化学发光法、酶联免疫吸附法、等离子体共振法、纳米粒子法、过渡金属羰基碎片法等。而利用荧光传感器实现对蛋白质检测的方法备受关注，主要是因为荧光传感器具有选择性好、灵敏度高、动态响应范围宽、可实时在线检测、能够成像和输出信号丰富等优点。然而现有的可检测蛋白质的荧光探针分子对分子合成技术有着较高的依赖，且大多疏水性较强，限制了其在水溶液中的应用以及对生物检测对象的传感。另外，蛋白质种类繁多，对蛋白质的区分识别则更具有重要意义。然而，目前已发展的几种可对蛋白质区分识别的荧光传感器多为阵列型传感器，即利用多个荧光探针组合而成的传感器阵列，通过采集不同传感器的荧光响应信号，形成针对特定蛋白的指纹识别图谱，从而实现对各种蛋白质的区分识别。阵列型传感存在样品消耗量大、数据采集复杂等问题。因此，发展能够有效区分识别蛋白质的单一型荧光传感器就显得非常具有挑战性和优越性。

目前，基于苝酰亚胺衍生物聚集体构象调控的荧光传感器对蛋白质进行区分检测方面的报道很少。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针及其合成方法和应用，该荧光探针灵敏度高、区分性好、测试范围广、样品消耗量小、数据采集简单；该合成方法操作简便，成本低，对设备要求简单；该荧光探针能够应用于蛋白质的检测和区分识别工作中。

为了达到上述目的，本发明荧光探针采用以下技术方案：

该荧光探针的结构式如下：

式中，n＝2、3或4。

本发明合成方法采用以下技术方案：包括以下步骤：

1)首先在保护气氛下，将芘磺酰基衍生物的N-甲基吡咯烷酮溶液加入到苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入无水醋酸锌，得到混合溶液；其中芘磺酰基衍生物和苝酐的摩尔比为(2～4):1；

2)步骤1)得到的混合溶液在搅拌条件下并在150～200℃下加热回流10～15h，待加热回流得到的反应液冷却到室温后，过滤得滤液；滤液经酸洗出现沉淀，抽滤得到滤饼，将滤饼洗涤干燥后，得到双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针。

进一步地，芘磺酰基衍生物的制备步骤具体包括：

a)在保护气氛及冰浴条件下，将芘磺酰氯的三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烃的三氯甲烷溶液中，滴加完毕后，室温搅拌反应2～8h；

b)反应结束后，将反应液洗涤并干燥，再依次酸洗、碱洗和萃取，得到有机层，旋干，制得结构式如下的芘磺酰基衍生物：

式中，n＝2、3或4。

进一步地，步骤a)中芘磺酰氯与二氨基含氧烷烃的摩尔比为1:(5～10)，二氨基含氧烷烃为1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷、3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺或3,6,9,12-四氧杂十六烷-1,16-二胺；步骤b)中的洗涤是用饱和食盐水洗6～7次，干燥是用无水硫酸钠干燥过夜，酸洗是采用1mol/L盐酸洗涤，碱洗是采用3mol/L氢氧化钠水溶液进行洗涤。

进一步地，步骤a)中，调节滴加速度为5～8s/滴。

进一步地，保护气氛采用氮气、氩气或氖气，保护气氛的流速为0.5～0.8mL/s。

进一步地，步骤1)中，无水醋酸锌的添加量为苝酐摩尔量的0.65～2倍。

进一步地，步骤2)中，酸洗是将滤液滴加到2mol/L的盐酸溶液中，产生沉淀。

进一步地，酸洗后抽滤得到的滤饼依次用甲醇及二次水淋洗；滤饼洗涤干燥后经过洗脱剂进行过柱分离纯化，其中洗脱剂采用二氯甲烷、甲醇和三乙胺按体积比为(20～60):1:1配成的混合溶剂。

本发明荧光探针在检测蛋白质中的应用，所述的蛋白质包括胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素c。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开了一种双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针PEPBI，该探针以对微环境敏感、荧光量子产率高、荧光输出信号丰富的芘以及具有良好的光化学稳定性、高的热稳定性、宽的吸收波长范围的苝酰亚胺为双报告基团，通过引入寡聚乙氧基的亲水性连接臂，制备了具有多个发射带的荧光衍生物。该探针分子中的芘基团可在480-500nm发射激基缔合物峰，与苝酰亚胺分子的吸收峰可以很好的重合，使得芘和苝酰亚胺基团形成一对很好的能量供体和受体，实现荧光共振能量转移，有望赋予该荧光探针分子在单一激发波长下具有多个发射和检测信号，从而使得传感体系具有多波长交互响应的识别性能，为创建新型的表面活性剂调控的荧光传感器提供了可能。该双芘修饰苝酰亚胺衍生物作为荧光探针，具有良好的化学稳定性好、快的响应速度和优异的识别性能。

本发明公开的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针的合成方法中采用双芘修饰苝酰亚胺分子，苝酰亚胺分子具有宽的波长吸收范围、较高的荧光量子产率以及好的光化学稳定性，并且由于其强的π-π堆积作用，使其在水溶液中具有特殊的自组装能力，可形成特定的非共价超分子聚集体；芘同样具有良好的荧光发射性能和较高的荧光量子产量，其所形成的激基缔合物可作为苝酐的能量供体，与苝酐进行能量转移，合成双芘修饰的苝酐衍生物可具有芘的单体发射、激基缔合物发射和苝酐发射的多发射带光谱，且光谱形状与探针分子的聚集状态密切相关，从而赋予荧光探针分子多个响应信号，使得传感体系具有多波长交互响应的识别性能，创建新型的表面活性剂调控的荧光传感体系，从而实现对多种蛋白质的区分传感；通过本发明构建的荧光化学传感体系具有灵敏度高、响应速度快、区分性好、样品消耗量小、数据采集简单等优点；本发明合成方法操作简便，区分性好，成本低，对设备要求简单。

本发明中的荧光探针具有多个检测信号，可实现对非金属蛋白中的胃蛋白酶(PS)、牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(O-egg)和β-乳球蛋白(BLG)的区分识别，以及金属蛋白中的铁蛋白(Ferr)、肌红蛋白(Myo)、血红蛋白(Hb)和细胞色素c(Cyt-c)的区分识别。荧光探针PEPBI对四种非金属蛋白胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白的检出限分别可达到0.61μmol/L(21.1μg/mL)、0.26μmol/L(17.3μg/mL)、0.46μmol/L(20.4μg/mL)和0.61μmol/L(21.4μg/mL)。荧光探针PEPBI对四种金属蛋白铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素c的检出限分别可达到61.8nmol/L(27.2μg/mL)、0.13μmol/L(2.2μg/mL)、41.6nmol/L(2.7μg/mL)和1.14μmol/L(14.1μg/mL)。

【附图说明】

图1是本发明实施例1制备的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针检测胃蛋白酶溶液的荧光强度变化曲线图。

图2是本发明实施例1制备的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针检测牛血清蛋白溶液的荧光强度变化曲线图。

图3是本发明实施例1制备的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针检测卵清蛋白溶液的荧光强度变化曲线图。

图4是本发明实施例1制备的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针检测β-乳球蛋白溶液的荧光强度变化曲线图。

图5是本发明实施例1制备的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针检测细胞色素c溶液的荧光强度变化曲线图。

图6是本发明实施例1制备的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针检测铁蛋白溶液的荧光强度变化曲线图。

图7是本发明实施例1制备的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针检测血红蛋白溶液的荧光强度变化曲线图。

图8是本发明实施例1制备的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针检测肌红蛋白溶液的荧光强度变化曲线图。

图9是荧光探针PEPBI在不同波长处(380、400、421、480、544、577nm)对四种非金属蛋白质(浓度为10μM)的荧光变化log(I/I₀)值的柱状图。

图10是荧光探针PEPBI在不同波长处(380、400、421、480、544、577nm)对四种金属蛋白质(浓度为1.0μM)的荧光变化log(I/I₀)值的柱状图。

【具体实施方式】

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明公开了一种双芘修饰苝酰亚胺衍生物的荧光探针，该荧光探针的结构式如下：

式中，n为2或3或4。

上述基于双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针的合成方法包括下述步骤：

1)合成芘磺酰基衍生物

在流速为0.5～0.8mL/s的保护气氛保护和冰浴条件下，将芘磺酰氯的三氯甲烷溶液以5～8s/滴的滴加速度滴加到二氨基含氧烷烃的三氯甲烷溶液中，其中保护气氛采用氮气、氩气或氖气等其他惰性气体，芘磺酰氯与二氨基含氧烷烃的摩尔比为1:(5～10)；滴加完后室温搅拌2～8h，将反应液用饱和食盐水洗6～7次，然后用无水硫酸钠干燥过夜，用1mol/L盐酸进行洗涤，再用3mol/L氢氧化钠水溶液进行中和，使pH值在7～8之间。用三氯甲烷萃取，收集萃取后的有机层，旋干，得到式Ⅰ所示的芘磺酰基衍生物，其反应方程式如下：

上述的二氨基含氧烷烃为1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷、3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺或3,6,9,12-四氧杂十六烷-1,16-二胺中的任意一种。

2)合成双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针

在流速为0.5～0.8mL/s的氮气气氛保护下，将芘磺酰基衍生物的N-甲基吡咯烷酮溶液加入到苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入催化剂量的无水醋酸锌，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩尔比为(2～4):1，无水醋酸锌的添加量约为苝酐摩尔量的0.65～2倍；磁力搅拌器搅拌，在150～200℃下加热回流10～15h，待反应液冷却到室温后，过滤，收集滤液。再将滤液滴加到2mol/L的盐酸溶液中，出现沉淀，搅拌，过夜。抽滤得到滤饼，依次用二次水及甲醇对滤饼进行多次淋洗，收集滤饼。然后再用二氯甲烷、甲醇和三乙胺按体积比为(20～60):1:1的混合溶剂作为洗脱剂柱层析纯化产物。之后，干燥，得到式Ⅱ所示的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针，其反应方程式如下：

上述的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在检测蛋白质中的用途，所述的蛋白质为胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素c，其检测方法如下：

1、配制溶液

准确称取一定量的CTAB，溶于HEPES缓冲液(10mmol/L，pH 7.4)中，配制成20mmol/L的CTAB溶液。将此溶液稀释成浓度为1.5mmol/L的溶液备用。量取25mL 1.5mmol/L的CTAB溶液，加入100μL浓度为2.5×10^-4mol/L双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针PEPBI的二甲亚砜溶液，配制成荧光探针浓度为1μmol/L、表面活性剂CTAB浓度为1.5mmol/L的传感体系，即PEPBI/CTAB体系，分别对非金属蛋白中的胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白以及金属蛋白中的铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素c进行区分检测。

分别称取一定质量的胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素c溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中，配制成2.5mmol/L胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、细胞色素c溶液以及0.25mmol/L铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白溶液。

2、绘制标准分类图谱

分别量取2.5mL的PEPBI/CTAB(1μmol/L/1.5mmol/L)荧光探针溶液于比色皿中，向其中分别滴加2.5mmol/L胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、细胞色素c溶液以及0.25mmol/L铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白溶液，用毛细管搅拌使其混合均匀，所得到的溶液中胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、细胞色素c的浓度均为0～20μmol/L，铁蛋白、血红蛋白浓度均为0～1μmol/L，肌红蛋白的浓度为0～2μmol/L。荧光光谱的测试均在单光子荧光光谱仪(FS5，Edinburgh)上完成，光源为150W的氙灯，样品的激发波长为352nm，激发与发射狭缝分别为3.5和2.7nm。待溶液达到平衡后，分别绘制荧光强度随胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素c浓度变化的荧光光谱图，并通过采集双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm处的荧光强度，算得四种非金属蛋白质浓度为10μmol/L时传感体系的log(I/I₀)值以及四种金属蛋白质浓度为1.0μmol/L时传感体系的log(I/I₀)值，分别绘制非金属蛋白浓度为10μmol/L、金属蛋白浓度为1.0μmol/L时不同波长处log(I/I₀)值的标准柱状图。

本发明合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针的化学稳定性好、响应速度快、区分性好、样品消耗量小、数据采集简单，可直接进行检测，如FS5、FLS920型单光子计数时间分辨荧光光谱仪或其他类似的光学检测器，分别实现对胃蛋白酶、牛血清蛋白、卵清蛋白和β-乳球蛋白以及对铁蛋白、肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素c的区分检测。

实施例1

合成结构式如下的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针：

其合成方法包括如下步骤：

1)合成芘磺酰基衍生物

在流速为0.6mL/s的氮气保护和冰浴搅拌条件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口烧瓶中加入9.97mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后将0.997mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按6s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯与1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩尔比为1:10。滴加完后室温搅拌2小时，停止反应后，将反应液用饱和食盐水洗6～7次，然后用无水硫酸钠干燥过夜，再用1mol/L盐酸进行洗涤，再用3mol/L氢氧化钠水溶液进行中和，使溶液pH值在7，之后用三氯甲烷萃取，收集有机层，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺酰基衍生物，其反应方程式如下：

2)合成双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针

在流速为0.6mL/s的氮气气氛保护下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺酰基衍生物0.64mmol，将其加入到12mL溶有0.32mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入催化剂量的无水醋酸锌0.208mmol，此时，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩尔比为2:1，无水醋酸锌的添加量约为苝酐摩尔量的0.65倍；然后用磁力搅拌器搅拌，在180℃下加热回流15h，待反应液冷却到室温后，过滤，收集滤液。然后再将其滴到300mL的2mol/L盐酸溶液中，搅拌过夜，抽滤，依次用二次水及甲醇对滤饼进行多次淋洗。收集滤饼，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按体积比为40:1:1的混合溶剂作为洗脱剂柱层析纯化产物。之后，得到式I所示的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针，其反应方程式如下：

上述结构式I的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针的核磁数据为：¹H NMR(CDCl₃/Me₄Si,600MHz),δ(ppm):8.88(d,1H,pyrene),8.35(d,1H,pyrene),8.16(s,1H,pyrene),8.14(s,1H,perylene),8.03(d,1H,perylene),7.97(d,1H,pyrene),7.87(d,1H,perylene),7.80(s,1H,perylene),7.65(t,3H,pyrene),5.95(s,1H,-NH-),3.26-4.44(m,12H,-CH₂NH-and-CH₂O-).

实施例2

合成结构式如下的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针：

其合成方法步骤如下：

在实施例1的合成芘磺酰基衍生物步骤1中，将所用的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷用等摩尔质量的3,6,9-三氧杂十一烷-1,11-二胺替换，其它步骤与相应的实施例1相同。

实施例3

合成结构式如下的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针：

其合成方法步骤如下：

在实施例1的合成芘磺酰基衍生物步骤1中，将所用的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷用等摩尔质量的3,6,9,12-四氧杂十六烷-1,16-二胺替换，其它步骤与相应的实施例1相同。

实施例4

1)合成芘磺酰基衍生物

在流速为0.5mL/s的氩气保护和冰浴搅拌条件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口烧瓶中加入5mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后将1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按5s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯与1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩尔比为1:5。滴加完后室温搅拌3小时，停止反应后，将反应液用饱和食盐水洗6～7次，然后用无水硫酸钠干燥过夜，再用1mol/L盐酸进行洗涤，再用3mol/L氢氧化钠水溶液进行中和，使溶液pH值在7.5，之后用三氯甲烷萃取，收集有机层，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺酰基衍生物，其反应方程式如下：

2)合成双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针

在流速为0.5mL/s的氩气气氛保护下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺酰基衍生物0.63mmol，将其加入到12mL溶有0.21mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入无水醋酸锌0.168mmol，此时，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩尔比为3:1，无水醋酸锌的添加量约为苝酐摩尔量的0.8倍；然后用磁力搅拌器搅拌，在150℃下加热回流10h，待反应液冷却到室温后，过滤，收集滤液。然后再将其滴到300mL的2mol/L盐酸溶液中，搅拌过夜，抽滤，依次用二次水及甲醇对滤饼进行多次淋洗。收集滤饼，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按体积比为30:1:1的混合溶剂作为洗脱剂柱层析纯化产物。之后，得到式I所示的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针。

实施例5

1)合成芘磺酰基衍生物

在流速为0.8mL/s的氖气保护和冰浴搅拌条件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口烧瓶中加入8mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后将1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按8s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯与1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩尔比为1:8。滴加完后室温搅拌8小时，停止反应后，将反应液用饱和食盐水洗6～7次，然后用无水硫酸钠干燥过夜，再用1mol/L盐酸进行洗涤，再用3mol/L氢氧化钠水溶液进行中和，使溶液pH值在7.5，之后用三氯甲烷萃取，收集有机层，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺酰基衍生物，其反应方程式如下：

2)合成双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针

在流速为0.8mL/s的氖气气氛保护下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺酰基衍生物0.60mmol，将其加入到12mL溶有0.15mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入无水醋酸锌0.3mmol，此时，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩尔比为4:1，无水醋酸锌的添加量约为苝酐摩尔量的2倍；然后用磁力搅拌器搅拌，在200℃下加热回流12h，待反应液冷却到室温后，过滤，收集滤液。然后再将其滴到300mL的2mol/L盐酸溶液中，搅拌过夜，抽滤，依次用二次水及甲醇对滤饼进行多次淋洗。收集滤饼，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按体积比为60:1:1的混合溶剂作为洗脱剂柱层析纯化产物。之后，得到式I所示的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针。

实施例6

1)合成芘磺酰基衍生物

在流速为0.7mL/s的氮气保护和冰浴搅拌条件下，向盛有60mL三氯甲烷的三口烧瓶中加入7mmol的1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷，然后将1mmol的芘磺酰氯溶于50mL三氯甲烷中并按7s/滴的速率滴加到上述溶液中，得到混合溶液，混合溶液中芘磺酰氯与1,8-二氨基-3,6-二氧辛烷的摩尔比为1:7。滴加完后室温搅拌7小时，停止反应后，将反应液用饱和食盐水洗6～7次，然后用无水硫酸钠干燥过夜，再用1mol/L盐酸进行洗涤，再用3mol/L氢氧化钠水溶液进行中和，使溶液pH值在8，之后用三氯甲烷萃取，收集有机层，旋干，得到式Ⅱ所示的芘磺酰基衍生物，其反应方程式如下：

2)合成双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针

在流速为0.7mL/s的氮气气氛保护下，用3mL N-甲基吡咯烷酮溶解芘磺酰基衍生物0.50mmol，将其加入到12mL溶有0.2mmol苝酐的N-甲基吡咯烷酮溶液中，再加入无水醋酸锌0.3mmol，此时，芘磺酰基衍生物和苝酐的摩尔比为2.5:1，无水醋酸锌的添加量约为苝酐摩尔量的1.5倍；然后用磁力搅拌器搅拌，在160℃下加热回流14h，待反应液冷却到室温后，过滤，收集滤液。然后再将其滴到300mL的2mol/L盐酸溶液中，搅拌过夜，抽滤，依次用二次水及甲醇对滤饼进行多次淋洗。收集滤饼，再用二氯甲烷、甲醇、三乙胺按体积比为20:1:1的混合溶剂作为洗脱剂柱层析纯化产物。之后，得到式I所示的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针。

实施例7

实施例1合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在水相中检测胃蛋白酶的用途，其使用方法如下：

1、配制溶液

向1.5mmol/L CTAB的HEPES缓冲溶液(10mmol/L，pH 7.4)中加入双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针PEPBI，配制成1.0μmol/L荧光探针溶液。称取一定质量的胃蛋白酶溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中，配制成2.5mmol/L胃蛋白酶溶液。

2、绘制标准曲线

量取2.5mL 1.0μmol/L荧光探针的CTAB溶液(1.5mmol/L)于比色皿中，加入2.5mmol/L胃蛋白酶溶液，用毛细管搅拌使其混合均匀，使得混合溶液中胃蛋白酶的浓度分别为1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、10、15和20μmol/L。荧光光谱的测试均在单光子荧光光谱仪(FS5，Edinburgh)上完成，光源为150W的氙灯，样品的激发波长均为352nm，激发与发射狭缝分别为3.5和2.7nm。待溶液达到平衡后，绘制荧光强度随胃蛋白酶浓度变化的荧光光谱图，实验结果见图1，由图可见，随着胃蛋白酶浓度的增加，体系的荧光呈现比例型变化。

实施例8

实施例1合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在水相中检测牛血清蛋白的用途，其使用方法与实施例7相同。实验结果见图2，由图可见，随着牛血清蛋白浓度的增加，体系的荧光呈现比例型变化。

实施例9

实施例1合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在水相中检测卵清蛋白的用途，其使用方法与实施例7相同。实验结果见图3，由图可见，随着卵清蛋白浓度的增加，体系的荧光呈现比例型变化。

实施例10

实施例1合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在水相中检测β-乳球蛋白的用途，其使用方法与实施例7相同。实验结果见图4，由图可见，随着β-乳球蛋白浓度的增加，体系的荧光呈现比例型变化。

实施例11

实施例1合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在水相中检测细胞色素c的用途，其使用方法与实施例7相同。实验结果见图5，由图可见，随着细胞色素c浓度的增加，体系的荧光呈现猝灭型变化。

实施例12

实施例1合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在水相中检测铁蛋白的用途，其使用方法如下：

1、配制溶液

向1.5mmol/L CTAB的缓冲溶液(10mmol/LHEPES，pH 7.4)中加入双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针，配制成1.0μmol/L荧光探针的CTAB溶液。称取一定质量的铁蛋白溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中，配制成0.25mmol/L铁蛋白溶液。

2、绘制标准曲线

量取2.5mL 1.0μmol/L荧光探针溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L铁蛋白溶液，用毛细管搅拌使其混合均匀，使得混合溶液中铁蛋白的浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7和1.0μmol/L。荧光光谱的测试均在单光子荧光光谱仪(FS5，Edinburgh)上完成，光源为150W的氙灯，样品的激发波长均为352nm，激发与发射狭缝分别为3.5和2.7nm。待测试完毕后，绘制荧光强度随铁蛋白浓度变化的荧光光谱图，实验结果见图6，由图可见，随着铁蛋白浓度的增加，体系的荧光呈现猝灭型变化。

实施例13

实施例1合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在水相中检测血红蛋白肌红蛋白的用途，其使用方法与实施例12相同。实验结果见图7，由图可见，随着血红蛋白浓度的增加，体系的荧光呈现猝灭型变化。

实施例14

实施例1合成的双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针在水相中检测肌红蛋白的用途(肌红蛋白的浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5和2.0μmol/L)，其使用方法与实施例12相同。实验结果见图8，由图可见，随着肌红蛋白浓度的增加，体系的荧光呈现猝灭型变化。

实施例15

采集双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm处的荧光强度，绘制四种非金属蛋白浓度为10μM时不同波长处log(I/I₀)值的标准柱状图，实验结果见图9，由图可见，四种非金属蛋白质在同一浓度下有不同程度的响应。

实施例16

采集双芘修饰苝酰亚胺衍生物荧光探针PEPBI在380nm、400nm、421nm、480nm、544nm、577nm处的荧光强度，绘制四种金属蛋白浓度为1.0μM时不同波长处log(I/I₀)值的标准柱状图，实验结果见图10，由图可见，四种金属蛋白质在同一浓度下有不同程度的响应。

通过以上实施例，可以得到，在本发明选定的传感体系中，分别加入四种非金属蛋白和四种金属蛋白，体系可以实现对非金属蛋白的比例型响应以及对金属蛋白的猝灭型响应。并且，通过采集不同波长处的荧光强度，做出log(I/I₀)对蛋白质浓度的柱状图，就可以分别实现对非金属蛋白和金属蛋白的指纹图谱识别，从而实现对各种蛋白质的区分识别。