本发明属于抗虫转基因水稻Bt63的检测技术，尤其涉及抗虫转基因水稻Bt63的现场定量检测技术，具体为米或米制品中是否含有转基因水稻Bt63的检测法。
背景技术：
：近年来，全球转基因作物的商业化迅猛发展，种植面积由1996年的170万公顷增加至2014年的1.8亿公顷，19年中增加了100多倍。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，在我国粮食生产中占有举足轻重的地位，转基因水稻研发进展也较为迅速，已经有多个转基因水稻优良品系进入环境释放阶段，申请商业化种植。与此同时，转基因技术对环境和食品安全的潜在风险已引起全球的广泛关注，国际贸易纠纷时有发生。2012年初，欧盟委员会发布了《对中国出口大米制品中含有转基因成分采取紧急措施的决定》，欧盟将对中国25种米制品采取强制性转基因成分检测，并依据检测结果采取退货和销毁处理措施，中国官方必须在向欧盟出口前提交米制品非转基因证明的检验报告，表明是否含有转基因成分。2006年以来，已有法国、德国、意大利和奥地利等7个国家因为转基因大米污染对我国出口米制品采取了拒绝入境或撤架、召回等措施。另一方面，目前公众关注的焦点已从“是否是转基因”转移到“含有哪些转基因成分及各自的含量”上来，为满足公众知情权、管理水平和检测技术能力的需求，许多国家纷纷出台了转基因限量规定，如欧盟规定转基因作物的成分超过0.9％，必须进行标识；而日本的现行标准为5％；我国目前的标准最为严格，对转基因产品实行“零容忍”，只要在产品中检出转基因成分就需要进行标识，考虑到转基因低水平混杂等客观实际，目前这一“零容忍”政策在技术执法角度来讲过于苛刻。因此，从我国各口岸转基因检测水平的实际出发，为国家政策部门提出合理的转基因阈值迫在眉睫，首当其冲的便是开发转基因成分的精准定量检测方法，实现对转基因产品的绝对定量。技术实现要素：鉴于目前食品安全领域对食品安全检测技术和产品的迫切需求，本发明基于微滴式数字PCR技术，开发了一款可用于抗虫转基因水稻Bt63的精准定量检测方法和试剂盒。所述检测方法即为一种米或米制品中是否含有转基因水稻Bt63的微滴式数字PCR检测方法，包括：(1)设计引物探针：设计抗虫转基因水稻Bt63的内源和品系特异性引物探针：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRABt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ1(2)提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA：(3)数字微滴式PCR扩增：将步骤2)所得的待测样品的DNA、阳性对照的DNA、阴性对照的DNA分别利用步骤1)所得的引物探针进行以下操作：①步骤1)所得的引物引物探针用DEPC处理水进行溶解稀释，引物稀释至浓度为900nM，探针稀释至浓度250nM；②设置扩增反应体系：PCR反应体系从而分别得待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系；③所述待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系分别进行以下操作：将反应体系加入微滴发生板的样品孔中(避免产生气泡)，在相应微滴发生油孔中加入70μL微滴发生油，装好胶条，置于微滴发生器中形成微滴。之后，将发生好的微滴用8道移液器转移至0.2mLPCR反应管中(缓吸缓放)，用配套铝箔封口后，置于PCR仪上进行PCR反应，PCR反应参数为：95℃/10min；94℃/30s，57℃/30s，40个循环；98℃/10min。Ramprate2℃/s。从而分别得待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液；(4)结果检测与分析：将步骤(3)所得的反应液放入微滴式数字PCR仪的微滴分析器中，并在软件QuantaSoft上设定检测模式为ABS，检测FAM的荧光信号。仪器会自动分析每个微滴中荧光信号，然后，由QuantaSoft计算各样品相关基因拷贝数浓度。本发明所述的引物可委托TAKARA公司制备，HPLC纯化。本发明的步骤(3)的设置扩增反应体系中：2×ddPCRTMSupermixforProbes可通过市购的方式获得。本发明还提供一种米或米制品中是否含有转基因水稻Bt63的微滴式数字PCR检测试剂盒，包括：抗虫转基因水稻Bt63的内源引物和探针：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRA抗虫转基因水稻Bt63品系的特异性引物和探针：Bt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ1。所述试剂盒还包括2×ddPCRTMSupermixforProbes。在本发明中，提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA可使用CTAB分步离心法进行DNA提取，或使用性能等同或超过本方法的DNA提取试剂盒(如QIAGENDNA提取试剂盒等)，当采用商业试剂盒时，则操作步骤参照试剂盒说明书进行。本发明属于基于核酸的食品安全检测领域，不同于传统的核酸扩增，检测灵敏度高，能实现精准定量检测，实现对转基因产品的绝对定量。并且该方法还具有很强的前瞻性，可以方便的增加所需要检测的其他转基因品种。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。以下实施例1中所用到的5份样品，预先按照传统的荧光定量PCR方法进行检测，具体检测结果如表1所示。表1荧光定量PCR方法检测结果备注说明：1、阳性对照(positive)为Bt63转基因水稻标准品。2、阴性对照(negative)为非转基因稻米。实施例1米或米制品中是否含有转基因水稻Bt63的检测以表1中的样品1～5作为待测样品，以Bt63转基因水稻标准品为阳性对照，以非转基因稻米为阴性对照；依次进行以下步骤：1)设计引物：设计转基因水稻Bt63的对应探针引物，已采用实时荧光PCR方法对设计合成的内源基因和品系基因引物探针进行检测，结果表明所有引物探针均能有效扩增出靶基因(表1)，具体为：PLD-Forward：TGGTGAGCGTTTTGCAGTCPLD-Reverse：CTGATCCACTAGCAGGAGGTCPLD-Probe：FAM-TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCT-TAMRABt63-Forward：AGAGACTGGTGATTTCAGCGGBt63-Reverse：GCGTCCAGAAGGAAAAGGAATBt63-Probe：FAM-ATCTGCCCCAGCACTCGTCC-BHQ12)待测大米或米制品的前处理，依次进行以下步骤：使用CTAB分步离心法进行DNA提取，从而提取获得待测样品(即样品1～5)的DNA、阳性对照的DNA、阴性对照的DNA。3)数字微滴式PCR扩增：将步骤2)所得的待测样品的DNA(即，样品1～5的DNA)、阳性对照的DNA、阴性对照的DNA分别利用步骤1)的引物组进行以下操作：引物的溶解稀释：引物用DEPC处理水稀释至浓度成900nM；探针用DEPC处理水稀释至浓度成250nM。设置扩增反应体系，见表2：表2PCR反应体系从而分别得待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系；③所述待测样品反应体系、阳性对照反应体系、阴性对照反应体系分别进行以下操作：将反应体系加入微滴发生板的样品孔中(避免产生气泡)，在相应微滴发生油孔中加入70μL微滴发生油，装好胶条，置于微滴发生器中形成微滴。之后，将发生好的微滴用8道移液器转移至0.2mLPCR反应管中(缓吸缓放)，用配套铝箔封口后，置于PCR仪上进行PCR反应，PCR反应参数为：95℃/10min；94℃/30s，57℃/30s，40个循环；98℃/10min。Ramprate2℃/s。从而分别得待测样品反应液、阳性对照反应液、阴性对照反应液；4)结果的判读：将步骤3)所得的反应液放入微滴式数字PCR仪的微滴分析器中，并在软件QuantaSoft上设定检测模式为ABS，检测FAM的荧光信号。仪器会自动分析每个微滴中荧光信号，然后，由QuantaSoft计算各样品相关基因拷贝数浓度。具体结果如表3所示。表3微滴式数字PCR检测结果检测结果阳性对照(positive)检出阴性对照(negative)未检出转基因大米Bt63(1)检出转基因大米科峰6号(2)未检出转基因大米克螟稻(3)未检出转基因大米LLRICE601(4)未检出米粉(5)未检出实施例2以非转基因大米及含量为0.1％、1％、10％的转基因水稻Bt63样品为模板，进行3次的重复定量试验，验证数字PCR检测方法的定量灵敏度。在非转基因大米定量结果为0％时，10％转基因大米Bt63样品检测结果为9.94％，1％转基因大米Bt63样品检测结果为1.01％，0.1％转基因大米Bt63样品检测结果为0.114％，表明本研究建立的ddPCR方法对转基因大米Bt63的定量检测灵敏度可达0.1％，检测结果见表4。表4不同含量Bt63水稻样品定量检测结果理论值(％)重复1重复2重复3平均值(％)109.959.899.979.9410.9751.0181.0231.010.100.1120.1090.1210.1140000/当前第1页1 2 3