判定rs4676410和rs2531875单核苷酸多态性与AS之间相关性的方法与流程

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种判定rs4676410和rs2531875单核苷酸多态性与AS之间相关性的方法。

背景技术：

强直性脊柱炎(AS)是一种主要侵犯脊柱，并累及骶髂关节和周围关节的慢性进行性炎性疾病。疾病。遗传和环境因素共同影响AS的发生发展过程。随着全基因组关联分析(GWAS)的兴起，现已发现一系列AS相关基因，如MHC、IL23R、ERAP1、RUNX3、IL6R、ANTXR2和CARD9等。尽管如此，AS发病机理仍不是很清楚。这些研究为更深入的了解AS这个复杂的疾病提供了理论。

G蛋白偶联受体35(GPR35)和一氧化氮合成酶2(NOS2)的基因多态性与诸多自身免疫系统疾病(如AS、银屑病等)的发病率显著相关。GPR35在免疫调节中有重要的作用，可调节免疫细胞如自然杀伤T(NKT)细胞等炎症因子的分泌，在免疫系统稳态维持中扮演十分重要的角色。NOS2是可诱导型一氧化氮合酶的一种，其催化合成NO在AS的发生发展过程中有重要作用。在GRP35的SNPs中，内含子区域的rs4676410可能影响GPR35的表达，并与自身免疫病炎症性肠病(IBD)相关。NOS2的SNPs中，内含子区域的rs2531875可能影响了NOS2基因的转录。这两个基因座与AS的相关性在中国大陆人中并未有报道。在此，我们拟通过新近发展起来的非标记探针高分辨率溶解曲线法，来研究中国人群rs4676410和rs2531875单核苷酸多态性与AS发病风险的相关性。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种方法，旨在用于判定中国人群rs4676410和rs2531875单核苷酸多态性与AS之间的相关性。

为实现上述目的，本发明提出的判定rs4676410和rs2531875单核苷酸多态性与AS之间相关性的方法，所述方法是非标记探针的高分辨率溶解曲线法。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

(1)基因分型：取外周血基因组DNA，鉴定其基因型；

(2)统计学分析：单核苷酸多态性与疾病相关性分析通过AS患者与正常人群次等位基因频率比较，以及用卡方检验或Fisher’s精确概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律结果来分析，P值小于0.05认为是有统计学意义；

(3)针对GPR35和NOS2内含子区域的rs4676410和rs2531875设计非标记探针，用于鉴别三种基因型的单核苷酸多态性，所述rs4676410的扩增序列如SEQID NO:1所示；所述rs2531875的扩增序列为如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，所述步骤(1)基因分型的具体流程为：

首先进行PCR，20mL体系含基因组DNA模板20ng，1′PCR缓存液(Takara，Japan)，200mM dNTPs，0.5U rTaq DNA聚合酶(Takara，Japan)，0.05mM正向引物，0.5mM反向引物。PCR反应在Bio-Rad S1000 PCR仪上进行(Bio-Rad，美国)；

PCR扩增条件如下：94℃预变性2分钟，继之进行50个循环，包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5min；

反应结束后，转移10mL PCR产物到HR-1专用的毛细管中，再加入1mL LCGreen Plus染料(Idaho Technology，USA)，最后以HRM in CFX96实时荧光系统C1000Thermal Cycler(Bio-Rad，美国)进行检测；

rs4676410引物序列为：正向SEQ ID NO:3，反向SEQ ID NO:4；rs2531875引物序列为：正向SEQ ID NO:5，反向SEQ ID NO:6。

本发明所述方法是通过非标记探针的高分辨率溶解曲线法进行AS患者进行基因分型，进而判定中国人群rs4676410和rs2531875单核苷酸多态性与AS之间的相关性。目前已经明确环境因素和基因因素在AS的发生发展中有重要的作用，因此本发明的研究结果为更深入的了解AS疾病提供了理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本中rs4676410的基因型和测序验证。

图2为非标记探针高分辨率溶解曲线法分析样本中rs2531875的基因型和测序验证。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1、研究对象

我们在北京大学深圳医院以及一些深圳地区合作医院收集根据美国风湿病学会(ACR)标准确诊的848例AS病人(男：660例，女：188例；年龄中位数为27岁；年龄跨度在11–57岁之间)和1123例正常人(男：645例，女：478例；年龄中位数为28岁；年龄跨度在15–59岁之间)。所有正常人均无AS家族史或患其他AS相关的疾病。本研究获得北京大学深圳医院伦理委员会同意及所有参与者的知情同意。

2、基因分型

采用Innogent的全基因组DNA提取试剂盒(Innogent，China)，根据试剂盒说明书要求提取所收集的外周血基因组DNA。采用非标记探针高分辨率溶解曲线的方法鉴定样本的基因型。方法简述如下：首先进行PCR，20mL体系含基因组DNA模板20ng，1′PCR缓存液(Takara，Japan)，200mM dNTPs，0.5U rTaq DNA聚合酶(Takara，Japan)，0.05mM正向引物，0.5mM反向引物。PCR反应在Bio-Rad S1000 PCR仪上进行(Bio-Rad，美国)。PCR扩增条件如下：94℃预变性2分钟，继之进行50个循环，包括94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸5min。反应结束后，转移10mL PCR产物到HR-1专用的毛细管中，再加入1mL LCGreen Plus染料(Idaho Technology，USA)后，最后以HRM in CFX96实时荧光系统C1000Thermal Cycler(Bio-Rad，美国)进行检测。rs4676410引物序列为：正向SEQ ID NO:3，反向SEQ ID NO:4；rs2531875引物序列为：正向SEQ ID NO:5，反向SEQ ID NO:6。

3、统计学分析

SNP与疾病相关性分析通过AS患者于正常人群次等位基因频率(MAF)比较，以及用卡方检验或Fisher’s精确概率法得出的Hardy-Weinberg平衡定律结果来分析。相关性程度以让步比(OR)的95％置信区间(95％CI)表示。连锁不平衡及单倍型分析均在SHEsis软件上完成。P值小于0.05认为是有统计学意义。

4、结果

高分辨率溶解曲线是近年来发展起来的一种高效廉价的SNP检测方法，通过此方法获得的溶解曲线能明显区分三种类型基因型(野生型，杂合突变及纯合突变)。HRMA的敏感性与精确度均较高。在此，我们针对GRP35和NOS2基因内含子区域的rs4676410(C>T)及rs2531875(G>T)设计了扩增引物并将扩增产物用于高分辨率熔解曲线分析，三种基因型的单核苷酸多态性(野生型、杂合突变及纯合突变)均可精确的鉴别(图1、2)。如图1和图2所示，从熔融曲线获得的基因型在PCR产物测序后得到进一步的证实。之后，这种方法应用于对本研究的筛查。

rs2531875和rs4676410单核苷酸多态性与AS的相关性

表1所示为AS患者和正常健康人群rs4676410和rs2531875的基因型及等位基因频率。AS患者和正常人群的基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡。AS患者rs4676410和rs2531875单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率与健康对照人群相比差异均有统计学意义。rs2531875(P＝0.0308，OR＝1.117，[95％CI 1.01-1.234])和rs4676410(P＝0.0237，OR＝1.109，[95％CI＝1.014-1.213])次等位基因对AS均有保护作用。

表1.Genotype and allele frequencies of indicated polymorphisms in controls and patients with AS

rs2531875和rs4676410单核苷酸多态性与AS诊断指标的相关性：为进一步分析两个SNP与AS的相关性，我们比较了rs2531875和rs4676410基因型和等位基因频率与AS的诊断指标之间的关系。结果发现只有rs4676410与虹膜睫状体炎的相关性具有统计学意义(补充内容部分表2)。同样，和rs4676410(P＝6.5E-04，OR＝1.403，[95％CI＝1.11-1.774])次等位基因对虹膜睫状体炎具有保护作用。

表2.Genotype and allele frequencies of rs4676410 and rs2531875 in AS patients with or without iridocyclitis

5、讨论

HRMA，中文译为“高分辨率熔解”是近几年来在国外兴起的最新的SNP及突变研究工具。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。这种方法因其操作简便、快速，使用成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。本文所设计的针对rs2531875和rs4676410的设计的特异性引物经PCR扩增后产物用HRMA法分型清晰，无需使用非标记探针法，可直接应用于临床。

GPR35是G蛋白偶联受体家族(GPCR)的一个成员，虽然发现了有近20年，但是其内源性配体和功能分析研究尚较少。一些全基因组关联研究已发现GPR35与一些疾病如炎性肠疾病，II型糖尿病和冠状动脉疾病等有相关性。最近的功能性研究也已发现其在心脏衰竭、缺氧、炎症、疼痛转导和突触传递等生物学过程中有重要作用。GPR35有调节白细胞功能的作用可以引起一些白细胞的粘附。定位于GPR35内含子区域的rs4676410 SNP(2q37)与GPR35的表达调控有一定的相关性。

SNP rs2531875(17q11)位于NOS2(一氧化氮合成酶2)基因，其编码在肝脏中表达的一氧化氮合成酶，是诱导脂多糖和某些细胞因子的组合。该基因可诱导一氧化氮合酶(iNOS)的激活和NO产量的增加，与AS患者骨质疏松症的产生有关。此外，AS患者十二指肠和结肠黏膜发现有淋巴细胞浸润和iNOS表达和活性的异常。rs2531875的不同基因型可能与NOS2的活性和表达有一定的相关性。

本研究中，我们发现rs4676410 SNP和rs2531875 SNP与AS显著相关，这与对其在其他一些人种中的研究结果一致。单倍型分析发现：rs4676410的TT与CC分别为AS的危险性和保护性的单倍型；s2531875 SNP的GG和TT分别为AS的危险性和保护性的单倍型。值得一提的是，rs2531875 SNP基因型及等位基因分布在亚洲人与欧洲人有所不同：欧洲人中rs2531875 SNP具有较高的G等位基因频率(39.6％)，与亚洲人群(29.6％)相差了10％左右，因此该位点相关的AS患病几率有所提升。

两个SNP与AS诊断指标的相关性进一步证实了其与AS的相关性。虹膜睫状体炎在AS中是一种反应自身免疫范围及严重性的指标，而rs4676410的次等位基因对其具有保护作用。

因此，通过本发明知道GPR35和NOS2内含子区域的基因突变可以引起GPR35和NOS2基因表达的异常，从而导致AS的发生与发展，使我们对AS预期诊断的筛查有较大的帮助，可以正确且迅速地判断是否有AS发病的可能性，本发明的研究结果为更深入的了解AS疾病提供了理论依据。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。