一株蜡状芽孢杆菌Y10及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用的制作方法

本发明涉及重金属污染生物防治
技术领域：
，具体地，涉及一株蜡状芽孢杆菌y10及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用。
背景技术：
：镉是最强的重金属元素之一，其污染具有隐蔽性，不可逆性、长期性以及危害性等特点。过量的镉会抑制正常的植物生长，在可食用的部分还会通过食物链进入到人体当中，危害人类的生理健康，如上世纪发生在日本富山县通川流域的“骨痛病”，以及湖南衡阳的镉大米事件等。镉被植物大量吸收后能产生各种生理毒害反应，通过损伤细胞结构，破坏植物呼吸作用、光合作用和营养代谢等影响植物的正常代谢活动和生长发育，致使作物减产，乃至死亡。且镉污染事件频发，因此镉污染的治理以及预防，目前是国际性的难题与研究热点，备受关注。利用生物修复镉污染的土壤与水体具有独特的作用，以其具有良好的社会、生态效益，易被广大群众接受，符合可持续发展战略，也具有广阔的应用前景。微生物既可以吸收重金属储藏与胞内，也可以改变根际微环境，降低土壤中重金属的毒性，如改变镉存在的形式，分泌相关多肽将镉螯合成为无效镉。现如今主要的粮食作物耕地正处于镉污染状态，因此减少耕地中的镉含量以及降低有效镉含量至关重要。蜡状芽孢杆菌具有降解大气、水体和土壤中二甲基二硫醚的能力，达到有效降解含硫恶臭物而起到保护环境的作用；降解多环芳烃（其中28种被视为持久性有机污染物）能力；降解除草剂草甘膦、敌草胺和烯酰吗啉农药残留、拟除虫菊酯类农药。也可特异性分泌角蛋白酶将禽类羽毛降解为多肽与氨基酸；分泌氨肽酶，将蛋白质深度水解、减弱蛋白酶解液的苦味，制备生产生物活性多肽；产磷脂酶c将卵磷脂降解产生可供植物利用的磷肥，促进南方红豆杉实生苗和杨树苗的生长发育，以及能够促进中国枫香苗的生长；其可作为外生菌根辅助细菌，与菌根真菌双接种可显著促进菌根真孢子萌发和菌丝生长，提高菌根侵染率，从而达到促进植物生长，如黑松（林木）的生长。当然其也具有较好的抑菌活性，能够明显抑制有害大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。技术实现要素：本发明针对现有技术的上述不足，提供一株蜡状芽孢杆菌y10，所述菌株具有快速繁殖、较强耐酸碱耐盐能力、生长势良好以及具有分泌促生长物质促进植物生长的能力。本发明的另一目的在于提供蜡状芽孢杆菌y10菌株在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用。为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：一株蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10，所述菌株于2016年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），菌种保藏号为gdmccno：60097，分类命名为蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus），保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。所述蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10菌株具有如下形态和生理、生化特性：a、菌体形态特性：蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10细胞呈棒杆状。b、菌落形态特性：在lb琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形，呈乳白色，中间凸起（37℃，生长24小时），菌落直径5-7毫米。ph生长范围较广，可耐ph值3-9，最适生长温度是37℃及最佳生长ph值7。c、生理生化特性：兼性好氧，能以淀粉、葡萄糖、柠檬酸盐、尿素、d-核糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、吐温80、l-络氨酸为唯一碳源的培养基上生长；不能发酵以阿拉伯糖、甘露醇、木糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、d-半乳糖、松三塘、蜜二糖，七叶苷、纤维二糖为碳源。菌株耐nacl的浓度达2.0%；对5μg/ml链霉素、新霉素，50μg/ml氨苄青霉素、红霉素；而对卡拉霉素、庆大霉素、和四环素氯霉素耐受性差、低浓度（5μg/ml）就能抑制其生长。进一步地，所述菌株的16srdna序列如seqidno：1所示。所述蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10生长和代谢过程中可以产生胞内巯基蛋白，将溶液中的镉富集与细胞内，降低溶液中的镉含量，改菌株还能分泌小分子物质至胞外与有效镉结合降低有效镉的含量，从而达到降低溶液中镉的含量。因此，本发明要求保护蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10菌株在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用。一种耐镉和/或降低有效镉含量的菌剂，含有如上所述的蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10菌株及辅料。优选地，所述菌剂中y10菌株的细胞密度od600为1。一种耐镉和/或降低有效镉含量的方法，将如上所述y10菌株制成od600为1的种子液，然后将种子液接种于镉污染的样品中，30～37℃培养3～36h。优选地，所述种子液接种于镉污染的样品中后，y10菌株在镉污染的样品中的最终细胞浓度od600为0.025。优选地，种子液接种于镉污染的样品中后在37℃培养24h，处理镉的效果最好。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一株蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10，所述蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10能够在液体培养基中快速大量繁殖，其生长和代谢过程中产生很多的胞内巯基蛋白，并将溶液中的镉富集与细胞内，从而降低溶液中的镉含量，并且该菌株可以分泌小分子物质至胞外与有效镉结合降低有效镉的含量，从而达到降低溶液中镉的含量。可用于制备耐镉和/或降低环境中镉重金属的菌剂，进而用于受镉污染的水资源和耕地土壤中。附图说明图1为菌株蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10接种到不同浓度含镉液体培养基中，不同时间处理后各处理的镉浓度；其中镉浓度分别为0、100、200、400μm。l代表离心处理后得上清液，g代表过滤处理后得滤液。图2为菌株y10的菌落图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。实施例1一、菌株的分离和纯化：发明人通过分离纯化广西梧县野生稻中的内生菌获得蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10，分离纯化的具体步骤为：将从广西梧县采取回来的野生稻用自来水冲洗干净，再用将从广西采取回来的野生稻用蒸馏水洗净，剪下长度3～5cm根、茎、叶分别置于已经灭过菌的碾砵当中碾碎，再置于磷酸缓冲液中悬浮样品，80℃高温温育10分钟。取20μl上清液于1ml无菌水中稀释，再取20μl稀释至1ml，后取20μl涂布于灭菌的lb固体平板培养基中，将平板于37℃培养箱中培养。观察菌体的生长情况，用接种环挑取长势较好并不同形态特征的菌苔，用平板划线法进行反复传代培养，直至菌落的颜色、形状、大小、质地和透明度一样。最后通过简单染色（石碳酸复红染色）和显微镜镜检（油镜），进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。纯化后的菌株于15%的甘油中-20℃和-80℃保存。二、耐镉菌株的筛选1、对步骤一所分离、纯化到的菌株划线于固体lb培养基平板，24h后将纯化的菌株接种到8ml含600μmol/ml镉的lb液体培养基中，37℃、120rpm培养24h，观察菌体生长情况，挑选出生长良好的菌体进行初筛。2、将步骤1得到具有耐镉生长的菌株，接种到100ml含0、100、200、400μmol.ml-1镉的lb液体培养基中，37℃、120rpm培养0、3、6、9、12、24和36h，期间各采样一次进行样品处理。于0、3、6、9、12、24和36h采取的菌液样品进行处理：14000rpm离心，获得上清液；一部分上清液用0.22μm的过滤器进行过滤得滤液，样品处理后利用原子吸收分光光度计测定处理液中的镉含量。在测定不同处理液中的镉含量后，数据如图1，表明y10具有将培养基中的镉富集与菌体细胞内，并且同样会分泌胞外蛋白将有效镉螯合成为无效镉，从而降低溶液中的镉含量。因此，采用上述方法成功筛选获得一株能对镉具有强耐受性且降低溶液中可溶性镉含量和更低的有效镉含量的菌株，命名为y10，数据见图1。从图1结果可以看出，在不同浓度镉处理下，菌株蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10在处理不同时间后，溶液中的有效镉含量呈现明显下降趋势，并且过滤后滤液中的有效镉含量明显少于离心上清液中。且在24h后，100μm过滤滤液中的镉含量由原来的11.25mg/l降至0.0242mg/l；200μm（22.5mg/l）镉浓度下，离心液上清液中的镉含量降至6.0001mg/l，过滤滤液中的镉含量降至4.627mg/l；400μm（45mg/l）镉浓度下，离心液上清液中的镉含量降至25.2145mg/l，过滤滤液中的镉含量降至21.4687mg/l。将分离纯化后的菌株y10在lb平板上培养1～2d后，收集平板上的菌体。保存于15%灭菌甘油(-20℃和-80℃)。实施例2菌株的鉴定和保藏：实施例1分离得到的一株蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10具有如下形态和生理、生化特性：a、菌体形态特性：蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10菌株呈棒杆状。b、菌落形态特性：在lb琼脂平板上生长速度较快，菌落圆形，呈乳白色，中间凸起（37℃，生长24小时），菌落直径5～7毫米（如图2）。ph生长范围较广，可耐ph值3～9，最适生长温度是37℃及最佳生长ph值7。c、生理生化特性：兼性好氧，能以淀粉、葡萄糖、柠檬酸盐、尿素、d-核糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、吐温80、l-络氨酸为唯一碳源的培养基上生长；不能发酵以阿拉伯糖、甘露醇、木糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、d-半乳糖、松三塘、蜜二糖，七叶苷、纤维二糖为碳源。菌株耐nacl的浓度达2.0%；对5μg/ml链霉素、新霉素，50μg/ml氨苄青霉素、红霉素耐受；而对卡拉霉素、庆大霉素、和四环素氯霉素耐受性差、低浓度（5μg/ml）就能抑制其生长。所述的蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）分子分类地位的确定：采用细菌16srrna基因通用引物进行pcr扩增，将pcr产物直接测序，获得菌株的16srdna序列（如seqidno：1所示），将16srdna序列输入genbank进行blast比对，初步确定本发明的y10菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的y10菌株与蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）模式菌株atcc14579相似性为100%，结合上述形态学特征、生理生化特性、16srrna系统发育分析及文献查阅，本发明的y10应归属于蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）。本发明所述的蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10已于2016年10月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），菌种保藏号为gdmccno：60097，分类命名为蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus），保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。实施例4耐镉菌株在高浓度镉条件下巯基含量测定：对具有耐镉能力的蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10划线与lb平板上，待其生长12h后，挑取单菌落接种于lb液体培养基中，37℃、120rpm培养12h，致使其生长至对数生长期，测定其od值。后将其接种至100ml含400μmolml-1镉的lb液体培养基中，使其菌体终浓度od6000为0.025，37℃、120rpm培养36h。用1.5ml离心管收集菌液，12000rpm，4℃离心10min，后将菌体与上清液分隔开，用于不同试验测定。将菌体用pbs洗涤2次，再用pbs重悬，冻融法裂解细胞，bradford蛋白定量法测定蛋白含量，ellman法定量测定巯基含量。同样方法将上清液代替细胞裂解液，测定上清液中的蛋白含量以及巯基含量，实验结果如表1。表1为镉处理菌体与上清液中巯基含量镉处理c(-sh)(巯基/蛋白mol/mg)c(-sh)(巯基/蛋白mol/mg)y10无5.440×10-54.601×10-6y10有61.010×10-54.836×10-6注明：巯基含量是表示蛋白中含有的巯基量。表1中数据说明，在镉浓度500μm（56.25mg/l）条件下，菌株y10合成的胞内蛋白巯基含量为61.01×10-5mol/mg，是空白菌株中的11.22倍；而菌体合成的胞外蛋白巯基含量相差不远，但是其胞外蛋白或者小分子物质也可以与有效镉结合，使有效镉沉默。结果表明菌株蜡状芽孢杆菌（bacilluscereus）y10具有耐镉生长特性，具有合成大量含巯基胞内蛋白，将胞外的镉富集于胞内的能力，并且不影响菌体的生长，其也可以分泌胞外物质与胞外的有效镉结合，使之成为无效镉，从而进一步降低有效镉含量，达到缓解镉的毒害胁迫作用。sequencelisting<110>华南农业大学<120>一株蜡状芽孢杆菌y10及其在耐镉和/或降低有效镉含量中的应用<130><160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1512<212>dna<213>16srdna<400>1ttattggagagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaa60gtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaaca120cgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggata180acattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatgga240cccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccg300acctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggc360agcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgat420gaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataagc480tggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggt540aatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggttt600cttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagac660ttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatgg720aggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcg780tggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagt840gttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggag900tacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcat960gtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaaaaccc1020tagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagct1080cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgcca1140tcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga1200cgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaa1260agagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggattgta1320ggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcgg1380tgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacaccc1440gaagtcggtggggtaacctttttggagccagccgcctaaggtgggacagatgattggggt1500gaagtcgtaaca1512当前第1页12