检测WRAP53基因突变的引物及其应用的制作方法

本发明涉及生命科学和生物技术领域，具体涉及检测WRAP53基因突变的引物及其应用。

背景技术：

先天性角化不良症(dyskeratosis eongenita，DC)是一种具有遗传异质性的骨髓衰竭综合征，发病率约为1/100万。典型的DC患者约80％～90％具有皮肤黏膜异常三联征，表现为皮肤网状色素沉着、指(趾)甲萎缩、口腔黏膜白斑。目前文献报道可引起DC的突变基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NHP2，NOP10及WRAP53。文献报道，这些基因有3种遗传方式，分别为X-连锁隐性遗传、常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传。但目前仍约50％患者遗传特征不明确。X-连锁隐性遗传包括DKC1，常染色体显性遗传包括TERC及TINF2，常染色体隐性遗传包括CTC1，WRAP53，NHP2，NOP10，既可以作为常染色体显性遗传又可以作为隐性遗传的有TERT。

端粒酶卡扎尔体蛋白1(telomerase cajal body protein 1，TCAB1又名WRAP53、WDR79)是2009年新发现的端粒酶关键核心蛋白组分，其主要存在于卡扎尔体蛋白中。WRAP53基因定位于染色体17p13上，与P53基因重叠，是P53的反义转录基因，它不仅能调节p53基因的表达还能调节端粒的合成。WRAP53表达的缺失不会影响端粒酶活性及TERC水平，但可在细胞的S期阻止端粒酶与端粒结合，最终导致端粒变短。有研究者发现WRAP53的突变阻止了端粒酶定位于卡扎尔体蛋白，导致了先天性角化不良症的发生。近年来，通过全基因组测序，发现WRAP53基因突变在先天性角化不良症患者中非常常见。目前文献报道在两个先天性角化不良症的家族中发现WRAP53基因存在突变点较多。目前国内文献报道的DC病例绝大多数为30岁左右皮肤受累的临床病例，病例数较少，且较少进行基因检测。因此有必要进行相关基因的突变检测，有必要先对患者进行WRAP53基因进行全外显子突变筛选，有助于对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种检测WRAP53基因突变的引物及其应用，所述引物可快速检测先天性角化不良症患者体内WRAP53基因多态位点的突变情况。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面，提供了检测WRAP53基因突变情况的引物，包括：

扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：

WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-2R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-3R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-4R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-5R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-6R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-8R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-9R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-10R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。

进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，引物序列WRAP53-1a F、WRAP53-1b F、WRAP53-1c F和WRAP53-1a R、WRAP53-1b R、WRAP53-1c R是扩增WRAP53基因第1外显子序列的引物，引物序列WRAP53-2F和WRAP53-2R是扩增WRAP53基因第2外显子序列的引物，引物序列WRAP53-3F和WRAP53-3R是扩增WRAP53基因第3外显子序列的引物，引物序列WRAP53-4F和WRAP53-4R是扩增WRAP53基因第4外显子序列的引物，引物序列WRAP53-5F和WRAP53-5R是扩增WRAP53基因第5外显子序列的引物，引物序列WRAP53-6F和WRAP53-6R是扩增WRAP53基因第6外显子序列的引物，引物序列WRAP53-7a F、WRAP53-7b F和WRAP53-7a R、WRAP53-7b R是扩增WRAP53基因第7外显子序列的引物，引物序列WRAP53-8F和WRAP53-8R是扩增WRAP53基因第8外显子序列的引物，引物序列WRAP53-9F和WRAP53-9R是扩增WRAP53基因第9外显子序列的引物，引物序列WRAP53-10F和WRAP53-10R是扩增WRAP53基因第10外显子序列的引物。

进一步地，引物序列M13-F和M13-R是测序WRAP53基因扩增产物全外显子序列的引物。

本发明第二方面，提供了上述检测WRAP53基因突变情况的引物在制备检测WRAP53基因突变情况的诊断试剂或药物中的应用。

本发明第三方面，提供了一种检测WRAP53基因突变情况的试剂盒，包括：

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中PCR扩增反应液引物为：

扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：

WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-2R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-3R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-4R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-5R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-6R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-8R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-9R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-10R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。

进一步地，测序体系试剂中测序引物，其碱基序列为：

检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

本发明第四方面，提供了一种检测WRAP53基因突变情况的方法，包括以下步骤：

(5)抽提血液中的基因组DNA；

(6)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；

(7)对步骤2中的扩增产物进行测序；

(8)对测序结果进行判断，确定WRAP53基因是否发生突变；

其中PCR扩增引物为：

WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-2R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-3R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-4R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-5R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-6R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-8R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-9R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-10R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。

进一步地，测序引物碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

本发明的有益效果：本发明设计了扩增WRAP53全部10个外显子序列的引物。通过加接头，使所有13对引物的PCR产物均可以用一种测序引物进行测序。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明所述引物既能将所述WRAP53全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。利用本发明的引物可快速地将先天性角化不良症患者体内WRAP53基因全外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可快速检测先天性角化不良症患者体内WRAP53基因全外显子序列的突变情况，对早期干预及早期治疗有重要的参考意义。

附图说明

图1为WRAP53基因在染色体上定位图。

图2为WRAP53-1a F/R、WRAP53-1b F/R、WRAP53-1c F/R、WRAP53-2F/R、WRAP53-3F/R、WRAP53-4F/R、WRAP53-5F/R、WRAP53-6F/R、WRAP53-7a F/R、WRAP53-7b F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-20为送检的血液样本。

图3为WRAP53-8F/R、WRAP53-9F/R、WRAP53-10F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，21-26为送检的血液样本。

图4为样本1的WRAP53第1号外显子野生型测序截图。

图5为样本1的WRAP53第2号外显子野生型测序截图。

图6为样本1的WRAP53第3号外显子野生型测序截图。

图7为样本1的WRAP53第4号外显子野生型测序截图。

图8为样本1的WRAP53第5号外显子野生型测序截图。

图9为样本1的WRAP53第6号外显子野生型测序截图。

图10为样本1的WRAP53第7号外显子野生型测序截图。

图11为样本1的WRAP53第8号外显子野生型测序截图。

图12为样本1的WRAP53第9号外显子野生型测序截图。

图13为样本1的WRAP53第10号外显子野生型测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测WRAP53基因突变情况的引物，包括：

扩增WRAP53基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：

WRAP53-1a F如SEQ ID NO：1所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA

WRAP53-1a R如SEQ ID NO：2所示：

AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC

WRAP53-1b F如SEQ ID NO：3所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC

WRAP53-1b R如SEQ ID NO：4所示：

AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT

WRAP53-1c F如SEQ ID NO：5所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC

WRAP53-1c R如SEQ ID NO：6所示：

AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG

WRAP53-2F如SEQ ID NO：7所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA

WRAP53-2R如SEQ ID NO：8所示：

AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA

WRAP53-3F如SEQ ID NO：9所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG

WRAP53-3R如SEQ ID NO：10所示：

AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC

WRAP53-4F如SEQ ID NO：11所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA

WRAP53-4R如SEQ ID NO：12所示：

AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA

WRAP53-5F如SEQ ID NO：13所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT

WRAP53-5R如SEQ ID NO：14所示：

AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC

WRAP53-6F如SEQ ID NO：15所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA

WRAP53-6R如SEQ ID NO：16所示：

AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC

WRAP53-7a F如SEQ ID NO：17所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG

WRAP53-7a R如SEQ ID NO：18所示：

AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC

WRAP53-7b F如SEQ ID NO：19所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG

WRAP53-7b R如SEQ ID NO：20所示：

AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC

WRAP53-8F如SEQ ID NO：21所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC

WRAP53-8R如SEQ ID NO：22所示：

AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG

WRAP53-9F如SEQ ID NO：23所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC

WRAP53-9R如SEQ ID NO：24所示：

AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC

WRAP53-10F如SEQ ID NO：25所示：

TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA

WRAP53-10R如SEQ ID NO：26所示：

AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。

引物序列WRAP53-1a F、WRAP53-1b F、WRAP53-1c F和WRAP53-1a R、WRAP53-1b R、WRAP53-1c R是扩增WRAP53基因第1外显子序列的引物，引物序列WRAP53-2F和WRAP53-2R是扩增WRAP53基因第2外显子序列的引物，引物序列WRAP53-3F和WRAP53-3R是扩增WRAP53基因第3外显子序列的引物，引物序列WRAP53-4F和WRAP53-4R是扩增WRAP53基因第4外显子序列的引物，引物序列WRAP53-5F和WRAP53-5R是扩增WRAP53基因第5外显子序列的引物，引物序列WRAP53-6F和WRAP53-6R是扩增WRAP53基因第6外显子序列的引物，引物序列WRAP53-7a F、WRAP53-7b F和WRAP53-7a R、WRAP53-7b R是扩增WRAP53基因第7外显子序列的引物，引物序列WRAP53-8F和WRAP53-8R是扩增WRAP53基因第8外显子序列的引物，引物序列WRAP53-9F和WRAP53-9R是扩增WRAP53基因第9外显子序列的引物，引物序列WRAP53-10F和WRAP53-10R是扩增WRAP53基因第10外显子序列的引物。

还包括测序引物，其碱基序列为：

检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：AACAGCTATGACCATG。

引物序列M13-F和M13-R是测序WRAP53基因扩增产物全外显子序列的引物。

一种检测WRAP53基因突变情况的试剂盒，包括

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，血液DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；WRAP53基因12个外显子序列的上、下游引物WRAP53-1a F(10μM)、WRAP53-1a R(10μM)、WRAP53-1b F(10μM)、WRAP53-1b R(10μM)、WRAP53-1c F(10μM)、WRAP53-1c R(10μM)、WRAP53-2F(10μM)、WRAP53-2R(10μM)、WRAP53-3F(10μM)、WRAP53-3R(10μM)、WRAP53-4F(10μM)、WRAP53-4R(10μM)、WRAP53-5F(10μM)、WRAP53-5R(10μM)、WRAP53-6F(10μM)、WRAP53-6R(10μM)、WRAP53-7a F(10μM)、WRAP53-7a R(10μM)、WRAP53-7b F(10μM)、WRAP53-7b R(10μM)、WRAP53-8F(10μM)、WRAP53-8R(10μM)、WRAP53-9F(10μM)、WRAP53-9R(10μM)、WRAP53-10F(10μM)、WRAP53-10R(10μM)。

测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、70％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测WRAP53基因全外显子序列的上、下游引物分别为M13-F(3.2μm)、M13-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。

实施例2

血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因组DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：检测体系PCR反应液中加入1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。

如图2和3所示，即为2例血液样本以WRAP53-1a F/R、WRAP53-1b F/R、WRAP53-1c F/R、WRAP53-2F/R、WRAP53-3F/R、WRAP53-4F/R、WRAP53-5F/R、WRAP53-6F/R、WRAP53-7aF/R、WRAP53-7bF/R、WRAP53-8F/R、WRAP53-9F/R、WRAP53-10F/R为引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为371bp、351bp、311bp、304bp、414bp、357bp、393bp、411bp、363bp、383bp、259bp、351bp、438bp，通过电泳图的分析表明本发明所述WRAP53-1a F/R、WRAP53-1b F/R、WRAP53-1c F/R、WRAP53-2F/R、WRAP53-3F/R、WRAP53-4F/R、WRAP53-5F/R、WRAP53-6F/R、WRAP53-7aF/R、WRAP53-7bF/R、WRAP53-8F/R、WRAP53-9F/R、WRAP53-10F/R扩增有效，且条带单一。

(6)Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与WRAP53野生型参考序列(Genbank accn：NC_000023.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取2例临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。电泳结果如图2和3所示，表明本发明所述引物WRAP53-1a F/R、WRAP53-1b F/R、WRAP53-1c F/R、WRAP53-2F/R、WRAP53-3F/R、WRAP53-4F/R、WRAP53-5F/R、WRAP53-6F/R、WRAP53-7aF/R、WRAP53-7bF/R、WRAP53-8F/R、WRAP53-9F/R、WRAP53-10F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本1的检测结果如图4-13所示：

图4显示是样本1的WRAP53 1号外显子野生型测序截图，说明样本1的1号外显子未发生突变。

图5显示是样本1的WRAP53 2号外显子野生型测序截图，说明样本1的2号外显子未发生突变。

图6显示是样本1的WRAP53 3号外显子野生型测序截图，说明样本1的3号外显子未发生突变。

图7显示是样本1的WRAP53 4号外显子野生型测序截图，说明样本1的4号外显子未发生突变。

图8显示是样本1的WRAP53 5号外显子野生型测序截图，说明样本1的5号外显子未发生突变。

图9显示是样本1的WRAP53 6号外显子野生型测序截图，说明样本1的6号外显子未发生突变。

图10显示是样本1的WRAP53 7号外显子野生型测序截图，说明样本1的7号外显子未发生突变。

图11显示是样本1的WRAP53 8号外显子野生型测序截图，说明样本1的8号外显子未发生突变。

图12显示是样本1的WRAP53 9号外显子野生型测序截图，说明样本1的9号外显子未发生突变。

图13显示是样本1的WRAP53 10号外显子野生型测序截图，说明样本1的10号外显子未发生突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出WRAP53基因全部10个外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出WRAP53基因全外显子，无论是野生型还是突变型。。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州华硕医学检验所有限公司

<120> 检测WRAP53基因突变的引物及其应用

<130>

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtgg gaacgggaaa ccttctaa 38

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacagctatg accatggaca gcagtccgga gctaac 36

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtaaaacga cggccagtct aatctccgct gtgcttcc 38

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacagctatg accatgtctt ctgcaggaag gcttgt 36

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtaaaacga cggccagtgg gacccagttt ctctctcc 38

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacagctatg accatgctgg agaagtgggt ctcagg 36

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtaaaacga cggccagtgt ggagtctggg gagatgaa 38

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacagctatg accatggggc atccctctcc tagaaa 36

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtaaaacga cggccagtca gccctagccc tacacttg 38

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aacagctatg accatgtgct gccacaagaa attcac 36

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtaaaacga cggccagttc tgagctcacc cttgaaca 38

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aacagctatg accatgctga ccagcccctc tgataa 36

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgtaaaacga cggccagtac acccagcctc atttttgt 38

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aacagctatg accatgggaa ggaaagggct gaaaac 36

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tgtaaaacga cggccagttc atatctggga cgcattca 38

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aacagctatg accatggtac agaggacggc gtgaac 36

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgtaaaacga cggccagtgc ttgtgacaga cagcatgg 38

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aacagctatg accatgtctc agggtgtgac ccctac 36

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tgtaaaacga cggccagttc tgtatgcctg ggatgatg 38

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aacagctatg accatgattg gtggtcacct ctcgac 36

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tgtaaaacga cggccagtct gaaggagtgc ctggagac 38

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

aacagctatg accatgaccc tacagctggg ctctg 35

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgtaaaacga cggccagtcc tctgccagca aatctctc 38

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aacagctatg accatgtctc tgtgggctca ggaaac 36

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgtaaaacga cggccagtag agggagcaag tgtcctca 38

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aacagctatg accatggcct ggtttcagga ccaata 36