水稻高精度分子标记Xa7‑SM7及其育种利用的制作方法

本发明涉及一个高抗水稻白叶枯病的基因的DNA标记及其在育种中的应用，属于分子遗传育种领域。

背景技术：

水稻白叶枯病是一种世界性的细菌病害，它与稻瘟病、纹枯病一起被称为水稻的“三大病害”。水稻遭遇白叶枯病后，一般减产20～30％，严重时可达50％，甚至绝收。发掘和利用抗病基因是防治水稻白叶枯病的最有效方法。迄今，国际上在水稻中已鉴定了近40个抗白叶枯病基因(国家水稻数据中心http://www.ricedata.cn)，但是只有少数几个兼具全生育期、广谱、持久等良好的抗病特性，真正能有效地用于水稻抗白叶枯病的育种和生产的基因并不多。水稻Xa7是一个来自孟加拉稻种的国际上公认的白叶枯病高抗基因，是水稻抗病育种中一个较为理想的抗源。因此，利用分子标记辅助育种(MAS)技术，将Xa7基因导入主栽的杂交稻恢复系中，有望大大提高我国水稻的抗病性和生产安全。而开发目的基因的高精度分子标记，是基因分子育种的关键，更能大大提高基因鉴定的精确度。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种水稻高抗白叶枯病基因特异性标记Xa7-SM7及其应用，本发明能用于Xa7基因的精准鉴定及其在水稻育种中应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻Xa7基因高精度分子标记Xa7-SM7，以水稻作为物种，该分子标记的扩增引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，

Xa7-SM7：

正向引物5’CATGCACTGATATCTTTCCTCACA 3’，

反向引物5’TCATATGCAATTCCTCCAAGTAG 3’。

即，本发明提供了一个可以特异性鉴定抗白叶枯病Xa7基因的紧密连锁或共分离标记(即，水稻抗白叶枯病基因Xa7的DNA标记)，该标记为Xa7-SM7。

本发明还同时提供了上述水稻Xa7基因高精度分子标记Xa7-SM7的用途：用于含Xa7的水稻与不含Xa7的水稻之间的分子检测及其后代的标记辅助选择。即，用于Xa7基因的精准的鉴定及其在水稻育种中应用。

作为本发明的水稻Xa7基因高精度分子标记Xa7-SM7的用途的改进：当PCR扩增产物的电泳中含有如SEQ ID NO：1所示序列时，为含Xa7的水稻；反之，则为不含Xa7的水稻。

即，引物Xa7-SM7PCR扩增所得的分子标记Xa7-SM7在含Xa7品种(例如IRBB7)中的序列如SEQ ID NO：1所述；引物Xa7-SM7PCR扩增所得的分子标记Xa7-SM7在不含Xa7品种(例如IR24)中不含有SEQ ID NO：1所述序列。

本发明还提供了上述水稻抗白叶枯病Xa7基因标记Xa7-SM7的用途：用于水稻Xa7基因的分子标记辅助选择育种。

发明人在发明过程中，

首先，利用“图位克隆”技术将Xa7基因精细定位于水稻第6染色体的50kb间，并分别构建了水稻含Xa7品种IRBB7与其近等基因系不含Xa7品种IR24的基因组文库，通过测序和比对两个品种定位区间的序列，发现IRBB7存在一些IR24中没有的差异序列。将这些序列在国际权威的生物学NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对，在现有的水稻DNA数据中没有搜索到相同或相似的序列，表明在IRBB7中这些序列是新发现的水稻基因组序列。因此，本发明利用以上序列中的1个位点，开发了1个新的DNA标记，用于精确的检测Xa7基因，在Xa7遗传育种中可以比较快速、精确的鉴定Xa7基因，大大提高基因转育的效率。

本发明的具体技术内容如下：根据以上在水稻IRBB7中发现的1个新DNA序列，分别设计PCR引物，开发出1个对应的DNA标记Xa7-SM7。用这个标记的引物，分别对含Xa7基因与不含Xa7基因的水稻品种基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，在含Xa7水稻品种的PCR产物中检测到1046bp(如SEQ ID NO：1所示)的条带，而不含Xa7水稻品种的PCR产物中检测不到无相应的条带(图1)。表明标记Xa7-SM7与Xa7基因具有很高的一致性，能精确的分析待测水稻品种是否含有Xa7基因，在Xa7遗传育种中可以大大提高基因转育的效率。

利用本发明检测出某个水稻品种内是否含有“Xa7基因位点”的最终目的是：确认在被测定水稻品种中是否含有Xa7基因。一般现在可采用白叶枯病菌的抗谱分析来鉴定Xa7基因的存在，但是该方法需要多个菲律宾生理小种，接菌条件包括水稻的生育时期、气候、温度等也比较严格，且鉴定可靠性不够高。

本发明操作简单，该标记的稳定性好，不受其它基因效应和环境因素的影响，可以大大提高Xa7基因的鉴定精确性，适于推广应用。本发明对水稻抗白叶枯的品种改良具有重要意义，可直接用于Xa7基因的辅助选择育种。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为IRBB7和IR24的Xa7-SM7标记检测图；

图1中：M.Marker；1.含Xa7基因的水稻品种IRBB7；2.不含Xa7基因的水稻品种IR24。

图2为各种已知含Xa7与不含Xa7水稻品种的Xa7-SM7标记检测图；

图2中：M.Marker；含Xa7基因的水稻品种：1.IRBB7(对照)，2.DV85，3.镇恢084；不含Xa7基因的水稻品种：4.日本晴，5.9311，6.浙辐802，7.中花11，8.TP309。

图3转育Xa7基因的成恢448的Xa7-SM7标记检测图；

图3中：M.Marker；1.IRBB7(对照)；2.成恢448(不含Xa7)；3.成恢448(转育了Xa7)。

图4转育Xa7基因的成恢448的白叶枯病抗性鉴定图；

图4中：横坐标P1～P10，国际公认用来鉴定水稻白叶枯病抗性的10个不同白叶枯病原菌小种；纵坐标，水稻叶片侵染白叶枯病菌后病斑的长度(单位cm)，病斑越短表明抗病性越强。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、

1、引物合成：委托Life Technologies公司合成Xa7-SM7标记的引物，引物序列为：5’CATGCACTGATATCTTTCCTCACA 3’和5’TCATATGCAATTCCTCCAAGTAG 3’。

2、DNA提取：以水稻的叶片为材料提取基因组DNA，已报道的DNA提取方法很多，可任意选择一种，本案例采用的是Panaud等(Mol Gen Genet,1996,252:597-607)报道的方法。

3、PCR扩增：在0.2ml的PCR扩增专用薄壁管中，加入20ng水稻DNA、两条引物各0.25μM、2×Taq PCR Master Mix(TIANGEN公司)、用ddH₂O定容到20μl，充分混匀。PCR扩增在热循环仪上进行，扩增条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。本发明采用的热循环仪为Biometra公司的T3000型。

4、PCR产物的电泳：用1×TAE电泳液制备浓度为1％(w/w)的琼脂糖凝胶，取步骤3所得的PCR产物10μl，与1μl 10×Loading Buffer混合，加到凝胶的点样孔中，在100V恒压下电泳30分钟。用溴化乙锭(Ethidium bromide，EB)对凝胶进行染色，显示DNA条带，染色方法按照《分子克隆》(冷泉港实验室出版社，第三版)。

6、电泳图谱分析：在紫外透射仪上，用305nm波段观察凝胶上的电泳条带，通过比对DNA Marker判断电泳条带的大小。以IRBB7的基因组DNA进行PCR扩增后，标记Xa7-SM7电泳条带的大小为1046bp(图1)，其序列为SEQ ID NO.1；以IR24的基因组DNA进行PCR扩增后，标记Xa7-SM7电泳无相应的条带(图1)。

为了证明本发明的正确性，发明人设置了如下验证试验：

实验1、

以水稻IRBB7作为对照，分别将事先已知含Xa7基因的水稻品种DV85、镇恢084，与已知不含Xa7基因的感病水稻品种日本晴、9311、浙辐802、中花11、TP309，按照实施例1所述的方法进行检测，最终结果如下(图2)：

已知含Xa7基因位点的水稻品种：镇恢084、DV85，所得的电泳条带均为1046bp。

而已知不含Xa7基因位点的水稻品种：日本晴、9311、浙辐802、中花11、TP309，电泳无相应的条带。

实施例2、

已知水稻品种成恢448不含Xa7基因(图3)，对白叶枯病的抗性较差(图4)。为了改良该水稻品种的抗病性，发明人以水稻品种成恢448为轮回亲本，与镇恢084杂交、回交。并利用本发明的标记Xa7-SM7对回交后代植株进行了逐代检测，选出扩增出1046bp条带的单株，即含有Xa7基因的植株，成功将Xa7基因转育到了成恢448中(图3)。通过水稻白叶枯病菌的抗性鉴定，也表明转育了Xa7基因的成恢448显著性增强了抗病性(图4)。

对比例1、

将实施例1中的引物改成如下序列：

正向引物5’CATGCACTGATATGGTTCCGCTAA 3’，

反向引物5’TCATATGCAATTCGTCCACTCTG 3’。

对比例2、

将实施例1中的引物改成如下序列：

正向引物5’CATGCACTGATATAATTCGAGACA 3’，

反向引物5’TCATATGCAATTCAACCATCTCG 3’。

利用上述2个对比例所得引物如同实验1所述进行试验，所得结果为：

对比例1：IRBB7、DV85和镇恢084电泳均无1046bp条带出现；因此无法进行有效区别。

对比例2：IRBB7、DV85和镇恢084电泳均无1046bp条带出现；因此无法进行有效区别。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江师范大学

<120> 水稻高精度分子标记Xa7-SM7及其育种利用

<160> 1

<210> 1

<211> 1046

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 1

catgcactga tatctttcct cacaaaaaaa attcactgat atttcatgct aacaatatcc 60

agaaagggta tgcttgtgag tatttaagct taaatgctat gaactgaatc tttgtggcca 120

taaattagct ttgggataaa aataacagaa gcttattata tggaagcaaa tcaaaaggat 180

tatttgatgc agctagcttt gaagtaaaag ttaaaatcat gtaaaattat ggaagagatc 240

gaatgactta gtggatttgc atgcaataga tatatagtag tcactagtca gcttctacaa 300

aacaatcaag atcaattata ttgaggattt ttgagttacc tgaggtggca gatttgattg 360

gtgatttcgt cctgcttcta tatcttcccc atgatggcca tgattcggca aagcttgcac 420

gacctgtatg agtgaaagat aatcgtcgtc agatctggat atgaacatca gaacatatat 480

ggagattcac taatctgatc ttttgtacaa cctattcaga atcaggtgcg tggatagcct 540

tagagagctt tctggtttat gaatcttagc tctacttgta tgaattgttc tttacttgac 600

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ttcttctctt gcgctagtcc atcatcctgt ttcatgcagc aaaaaggaat ttattaagaa 900

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ttgctacttg gaggaattgc atatga 1046