印楝素的发酵提取方法与流程

本发明涉及一种生物提取方法，尤其涉及一种印楝素的发酵提取方法。

背景技术：

植物内生菌更容易产生抗菌物质或新型生物活性物质。植物内生菌是指在某一时期生活在植物体内，但对寄主植物组织并不引起明显病害症状的细菌。包括那些在其生活史中的某一阶段营表面生活的腐生菌，以及对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌。内生菌能够产生活性很强的次生代谢产物，包括抗生素、杀昆虫物质、植物生长调节剂、抗肿瘤活性物质等，而这些化合物包括生物碱、甾醇、萜类、大环内酯等多种类型并具有新颖的化学结构,近年来已成为国内外研究的焦点。

印楝属楝科植物，为热带树种,具有很高的生物农药和医药价值。印楝杀虫剂是当今世界公认的最优秀的生物农药之一，对200多种昆虫有作用，具有很强的杀虫、拒食、抑制生长发育、胃毒、忌避、抑制呼吸、抑制昆虫激素分泌、抑制昆虫生育能力等作用。它的杀虫效果具有广谱、高效、低毒、无残留、对人畜无毒副作用、对害虫天敌安全及持效期长、不易产生抗药性等特点。印楝素是目前世界上公认的活性最强的拒食剂，因而被认为是最适合于商品化开发的植物源杀虫剂。但目前由于气候原因，国内只有海南、云南、广东可以引种栽培，印楝素制剂因价格居高不下无法广泛应用。

目前，全球有近20个国家对印楝素进行研究、开发和利用，国际上定期召开全球印楝科学与应用会议。1985年Grace在美国注册的印楝制剂“Margosano”是世界上第一个真正商品化的植物杀虫剂，而印楝素田间使用具有明显的局限性，最为突出的是其持效期短。目前，对印楝素的研究大部分停留在：(1)制剂稳定性能的研究：Sundram在实验中发现一种紫外光吸收剂能增强印楝素的稳定性；Szeto发现在PH1-7的缓冲液中其分解率不大，而在PH10的缓冲液中其分解则很快；Andrew发现印楝素在弱酸环境(PH4-6)很稳定。(2)印楝素分子结构与作用强度关系的研究：Enris等研究克罗登烷双萜结构的拒食活性，Deota等研究各种印楝素成分对拒食活性和昆虫毒性的大小等。(3)印楝细胞的培养条件的优化；(4)国内的研究集中在印楝素与其他农药混配制剂的开发的研究。华南农大是我国最早开始研究印楝素应用开发的单位。

关于印楝植物内生菌的研究，国外曾报道过生长在印度的印楝植物内生真菌的分离和鉴定；国内曾报道对云南元江印楝植物内生真菌进行分离并进行种类鉴定，邵士成等对印楝内生真菌的多样性及抗菌活性进行研究。但目前未见从印楝植物提取到含印楝素的内生菌，并从该内生菌发酵液提取印楝素的技术研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种印楝素的发酵提取方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括以下步骤：

(1)内生菌分离：采用自来水将所采集的印楝植物组织表面冲洗干净→晾干水分后分别切取不同组织部位，采用下述方法进行表面消毒：0.1％升汞漂洗10—30S→无菌水冲洗数次75％酒精漂洗30-60S→无菌水冲洗数次；在无菌操作条件下取组织块切成0.2cmx0.2cm长段，每个种源地的植株组织块植于加青霉素的PDA(马铃薯蔗糖琼脂糖)培养基中，在28±1℃条件下置于温箱静止培养；

(2)菌株纯化：将上述经表面灭菌的材料不做任何处理直接种植于加青霉素的PDA培养基中，在28±1℃条件下置于温箱培养，检查表面消毒是否彻底；将种植样品的PDA平板置于28±1℃温箱培养3-15d待各植物组织切面长出菌丝后挑取边缘部分移至新的PDA培养基上，划线法纯化；设两类空白对照,一类采用漂洗液检验法,另一类采用组织印迹法以上两种对照处理的分离培养基平板上无菌落出现,表明植物材料表面消毒彻底,分离到的是内生菌；

(3)菌种鉴定:采用P DA培养基和促孢培养基进行插片培养，对分离所得菌进行菌落特征和显微形态特征观察，并通过分子生物学方法做rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer，内转录间隔区)序列分析进行分子生物学鉴定；

(4)菌液发酵：将内生菌分别接种到250ml装有相对应培养基的三角瓶中，进行摇床培养，细菌在370C,150r/min培养2d，真菌在300C,150r/min培养3d.

(5)抗虫活性菌株筛选：选取有报道对印楝敏感的农业害虫(如斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、蚜虫、家蚕、菜青虫等)，采用虫体浸渍法：将实验室饲养的试虫用毛笔挑入漏勺中，在已发酵好的内生菌菌液中浸30s取出，自然晾干后，挑入直径12cm的培养皿中，并放入新鲜苞菜叶；设无菌水与对应的培养基为对照，每个处理20头，重复3次"于温度280C，光周期L:D＝16:8,相对湿度75％-85％的恒温生化培养箱中饲养,24,48,72,96,120h后观察其死亡虫数，并计算死亡率；或采用食叶浸渍法：取新鲜、幼嫩、没有施过药的甘蓝叶片，浸入已发酵好的内生菌菌液中10s取出，自然晾干，置于直径12cm的培养皿中(在叶柄部包裹沾有保湿剂的脱脂棉，以保证叶片新鲜)，用毛笔轻轻挑入饥饿12h的试虫，设无菌水和相应的发酵培养基为对照，每个处理20头，重复3次于温度280C，光周期L:D＝16:8,相对湿度75％-85％的恒温生化培养箱中培养24,48,72,96,120h后观察其死亡虫数，并计算死亡率；

(6)发酵产物提取：收集菌丝体，分别用乙醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等进行抽提，得到最佳提取工艺。

本发明的有益效果在于：

本发明是一种印楝素的发酵提取方法，与现有技术相比，本发明通过内生菌分离，发酵，提取发酵液中印楝活性物质获得抗虫活性较高的次生代谢产物是目前适合国内开发印楝农药的一条有效途径，具有非常大的市场开发潜力。

附图说明

图1是本发明的流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

如图1所示：本发明包括以下步骤：

(1)内生菌分离：采用自来水将所采集的印楝植物组织表面冲洗干净→晾干水分后分别切取不同组织部位，采用下述方法进行表面消毒：0.1％升汞漂洗10—30S→无菌水冲洗数次75％酒精漂洗30-60S→无菌水冲洗数次；在无菌操作条件下取组织块切成0.2cmx0.2cm长段，每个种源地的植株组织块植于加青霉素的PDA(马铃薯蔗糖琼脂糖)培养基中，在28±1℃条件下置于温箱静止培养；

(2)菌株纯化：将上述经表面灭菌的材料不做任何处理直接种植于加青霉素的PDA培养基中，在28±1℃条件下置于温箱培养，检查表面消毒是否彻底；将种植样品的PDA平板置于28±1℃温箱培养3-15d待各植物组织切面长出菌丝后挑取边缘部分移至新的PDA培养基上，划线法纯化；设两类空白对照,一类采用漂洗液检验法,另一类采用组织印迹法以上两种对照处理的分离培养基平板上无菌落出现,表明植物材料表面消毒彻底,分离到的是内生菌；

(3)菌种鉴定:采用P DA培养基和促孢培养基进行插片培养，对分离所得菌进行菌落特征和显微形态特征观察，并通过分子生物学方法做rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer，内转录间隔区)序列分析进行分子生物学鉴定；

(4)菌液发酵：将内生菌分别接种到250ml装有相对应培养基的三角瓶中，进行摇床培养，细菌在370C,150r/min培养2d，真菌在300C,150r/min培养3d.

(5)抗虫活性菌株筛选：选取有报道对印楝敏感的农业害虫(如斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、蚜虫、家蚕、菜青虫等)，采用虫体浸渍法：将实验室饲养的试虫用毛笔挑入漏勺中，在已发酵好的内生菌菌液中浸30s取出，自然晾干后，挑入直径12cm的培养皿中，并放入新鲜苞菜叶；设无菌水与对应的培养基为对照，每个处理20头，重复3次"于温度280C，光周期L:D＝16:8,相对湿度75％-85％的恒温生化培养箱中饲养,24,48,72,96,120h后观察其死亡虫数，并计算死亡率；或采用食叶浸渍法：取新鲜、幼嫩、没有施过药的甘蓝叶片，浸入已发酵好的内生菌菌液中10s取出，自然晾干，置于直径12cm的培养皿中(在叶柄部包裹沾有保湿剂的脱脂棉，以保证叶片新鲜)，用毛笔轻轻挑入饥饿12h的试虫，设无菌水和相应的发酵培养基为对照，每个处理20头，重复3次于温度280C，光周期L:D＝16:8,相对湿度75％-85％的恒温生化培养箱中培养24,48,72,96,120h后观察其死亡虫数，并计算死亡率；

(6)发酵产物提取：收集菌丝体，分别用乙醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等进行抽提，得到最佳提取工艺。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。