本发明涉及一种高效α螺旋抗菌肽GV及其制备方法和应用。
背景技术：
抗菌肽又称抗微生物肽或肽抗生素，是由细菌特定基因编码产生的一类小分子多肽，具有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性。抗菌肽通过碱性带正电荷的残基与细菌细胞膜上带负电荷的基团发生静电吸引，其疏水性氨基酸插入细菌细胞膜的脂质双分子层，造成膜的物理性损伤，导致细胞内容物外渗而死亡。抗菌肽的作用不涉及特定的受体，它可以很快杀灭微生物而不产生耐药性。另外抗菌肽本身是一种多肽类物质，不存在残留性问题，所以抗菌肽是抗生素最理想的替代物，具有极为广阔的市场应用前景。但尽管抗菌肽存在着种种优势，目前，只有极少数的抗菌肽被应用于医学、食品、畜牧等行业生产。抗菌肽的使用主要受限于高昂的合成成本和其对于正常细胞，例如对红细胞等造成溶血作用，也就是细胞选择性低，那么，寻找一种提高抗菌肽细胞选择性的方法势在必行。
抗菌肽一般由12-60个氨基酸残基组成，分子质量较小，种类繁多，结构复杂，因此很难找到统一的模型来代表所有抗菌肽进行研究。另外，人们盲目的使用基因工程的方法表达抗菌肽，而没有对抗菌肽的结构和功能以及体外试验进行全面的摸索，导致表达得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血活性。抗菌肽按其二级结构划分为以下四类：1)α-螺旋抗菌肽；2)β-折叠抗菌肽；3)环形抗菌肽；4)无规则卷曲抗菌肽。α-螺旋抗菌肽是抗菌肽家族中数量最多的一类抗菌肽，是抗菌肽的主要结构形式。蜂毒素(Melittin)是典型的α-螺旋抗菌肽，它的分子带有6个正电荷，含有3个赖氨酸残基和2个精氨酸残基。Melittin具有广谱抗菌活性，但溶血等细胞毒性也较高。
技术实现要素：
本发明是为了得到抗菌活性较高而细胞毒性相对较低的抗菌肽，从而提供了一种高效α螺旋抗菌肽GV及其制备方法和应用。
本发明所采用的技术如下：一种高效α螺旋抗菌肽GV，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：如上所述的一种高效α螺旋抗菌肽GV的制备方法包括如下步骤：
1)通过以α-螺旋肽GRX2RX3RX2RG，X＝V，为模板设计得到全新的抗菌肽GV；
2)采用固相化学合成法，通过多肽合成仪合成多肽粗品；将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，完成多肽的制备。
如上所述的一种高效α螺旋抗菌肽GV，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。
本发明通过以α-螺旋GRX2RX3RX2RG(X代表W，F，V，I，A和L)为模板设计得到全新的抗菌肽GW，GF，GV，GI，GA，GL，模板中的Arg(精氨酸；R)，是一种碱性氨基酸，提供的正电荷可与细菌表面的负电荷发生静电吸引作用。Trp(色氨酸；W)、Phe(苯丙氨酸；F)、Val(缬氨酸；V)、Ala(丙氨酸；A)、Leu(亮氨酸；L)和Ile(异亮氨酸；I)均是疏水性氨基酸，他们可与细菌表面的磷脂发生疏水性作用，破坏细菌的磷脂膜，从而产生生物学活性。尤其含有疏水性氨基酸缬氨酸(V)的抗菌肽GV具有高细胞选择性。
通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现GV不但对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鸡白痢沙门氏菌、粪链球菌八种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。因而，综合来看，GV是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
附图说明
图1为设计得到的抗菌肽GV的质谱图。
具体实施方式
实施例1
以α-螺旋肽GRX2RX3RX2RG(X代表W，F，V，I，A和L)为模板设计得到全新的α-螺旋肽GW，GF，GV，GI，GA，GL。
其氨基酸序列为：
将上述两个抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：
1)抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；
抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量与表一中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。
表1抗菌肽的设计
实施例2
对设计并合成得到的抗菌肽通过体外抑菌和溶血活性试验进行比较检测；
抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。
检测结果见表2。通过表2可以看出，GF、GV和GL对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较强的抑菌活性，而GA在检测范围几乎未检测到抑菌活性。
表2抗菌肽的抑菌和溶血活性表
溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mlPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μl PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μl 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。
检测结果见表2。溶血浓度越大，表明溶血活性越小；通过表2可以看出，只有GV和GA在检测范围内没有溶血活性，而GF、GW、GA、GL和GI在检测范围内均表现出较高的溶血活性。
以上结果显示，以α-螺旋肽GRX2RX3RX2RG(X代表W，F，V，I，A和L)为模板设计抗菌肽具有较高的抑菌活性(GA除外)，具有较高抗菌活性的GA在检测范围内没有溶血活性。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的细胞选择性。由表2可以看出，GV具有较高的治疗指数，表明设计得到的抗菌肽GV具有较高的替代抗生素的发展潜力。
<110> 东北农业大学
<120>一种高效α螺旋抗菌肽GV及其制备方法和应用
<160> 1
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Arg Val Val Arg Val Val Val Arg Val
1 5 10
Val Arg Gly-NH2
11 13