一种鲍鱼肌肉多糖及其制备方法与应用与流程

文档序号:11096018阅读:835来源:国知局
一种鲍鱼肌肉多糖及其制备方法与应用与制造工艺

本发明涉及一种多糖,尤其涉及一种从鲍鱼肌肉提取的新型多糖及其制备工艺和应用。



背景技术:

鲍鱼被誉为海洋人参,蛋白、多糖等营养物质和生物活性成分有助于促进人体健康。由于鲍鱼来源的多糖具有良好的抗氧化、增强免疫调节、抗肿瘤和抗凝血活性等功能,因此近年来从鲍鱼提取多糖已引起广泛的关注。中国专利公开号CN102898538 A公开一种鲍鱼内脏酸性多糖及含有其的保健品和应用,其鲍鱼内脏多糖主要是由鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖构成,可以用作一种保肝护肝的功能因子。然而,有关鲍鱼肌肉多糖的结构和功能却鲜有报道。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种鲍鱼肌肉多糖,所述多糖从鲍鱼肌肉中提取,具有良好的抑制乳腺癌和肝癌细胞生长繁殖的活性。

本发明还提供了所述鲍鱼肌肉多糖的制备工艺和应用。

本发明的内容为:

一种鲍鱼肌肉多糖,主要由葡萄糖及甘露糖组成,分子量为3200Da,其主链是由葡萄糖通过1→4糖苷键和1→6糖苷键构成,侧链是由1→6糖苷键组成,糖残基为α构型,具体结构为:

本发明还提供了所述鲍鱼肌肉多糖的制备方法,步骤为:

1、鲍鱼肌肉去除表面杂质后,与2-4倍重量冷水混合搅碎,然后在10-30℃下搅拌萃取0.5-2h,通过5000rpm离心15-30min除去不溶物后,获得上清液。

2、将步骤1获得的上清液用氢氧化钠调整pH至9.0,然后先后加入上清液质量体积比的1-2g/L碱性蛋白酶和1-2g/L胶原酶,在45-55℃下酶解1-3h。

3、用盐酸将步骤2获得的上清液的pH调整至6.0-7.0,再分别加入液体质量体积比的1-2g/L中性蛋白酶和1-2g/L木瓜蛋白酶,在45-55℃下酶解1-3h。

4、酶解结束后,通过旋蒸浓缩后,往浓缩液中加入无水酒精,使溶液中的酒精浓度达到20-40%,于常温下静置30-60min后,过滤除去沉淀。

5、在步骤4获得的滤液中继续缓慢添加无水酒精,使溶液中的酒精浓度达到80%,放在4℃下静置8-16h可以获得鲍鱼肌肉重量5-6%的沉淀物。

6、上述沉淀物用5-10倍沉淀物重量的蒸馏水溶解后,加入溶液质量体积比的5-20g/L的活性炭,在30-40℃下脱色1-3h后,通过5000rpm离心15-30min、过滤除去活性炭后,利用DEAE-52阴离子交换柱分离,收集水洗分离组分,再利用Sephadex-G交联葡聚糖凝胶层析纯化,最后通过冷冻干燥获得鲍鱼肌肉多糖,纯度为92%。

本发明还提供了上述鲍鱼肌肉多糖在治疗乳腺癌药品和保健品中的应用。

本发明还提供了上述鲍鱼肌肉多糖在治疗肝癌药品和保健品中的应用。

本发明的有益效果:

本发明提取的鲍鱼肌肉多糖为3200Da的葡聚糖,易于合成;具有良好的抑制乳腺癌和肝癌细胞生长繁殖的活性;本发明明确了鲍鱼肌肉多糖的分子结构,可以为合成提供参考;本发明采用冷水浸提,提取多糖后的鲍鱼肌肉残渣还可以用于其他产品开发,将起到多元化综合利用。

【附图说明】

图1是鲍鱼肌肉多糖甲基化前(a)和甲基化后(b)的红外图谱;

图2是鲍鱼肌肉多糖的1H NMR谱图;

图3是鲍鱼肌肉多糖的13C NMR谱图;

图4是鲍鱼肌肉多糖的HSQC谱图;

图5是鲍鱼肌肉多糖的COSY谱图;

图6是鲍鱼肌肉多糖的TOCSY谱图;

图7是鲍鱼肌肉多糖的HMBC谱图;

图8是鲍鱼肌肉多糖的ROESY谱图;

图9是鲍鱼肌肉多糖主链分子结构图;

图10是鲍鱼肌肉多糖对人体肝癌细胞(HepG2细胞)生长抑制的影响;

图11是鲍鱼肌肉多糖对人体乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)生长抑制的影响。

【具体实施方式】

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明,以下对于具体实施方案的描述仅用于解释本发明,并不限定本发明。

实施例1

1、1kg的鲍鱼肌肉去除表面杂质后,与4L冷水混合搅碎,然后在10℃下搅拌萃取2h,通过5000rpm离心15min除去不溶物后,获得4.5L的上清液。

2、将步骤1获得的上清液用氢氧化钠调整pH至9.0,然后先后加入4.5g碱性蛋白酶和4.5g胶原酶,在50℃下酶解2h。

3、用盐酸将步骤2获得的上清液的pH调整至6.5,再分别加入4.5g中性蛋白酶和4.5g木瓜蛋白酶,在50℃下酶解2h。

4、酶解结束后,通过旋蒸浓缩至0.5L,往浓缩液中加入0.33L的无水酒精,于常温下静置30min后,过滤除去沉淀。

5、在步骤4获得的滤液中继续缓慢添加1.67L的无水酒精,放在4℃下静置8h可以获得50g左右的沉淀物。

6、上述沉淀物用0.50L的蒸馏水溶解后,加入5g的活性炭,在30℃下脱色3h后,通过5000rpm离心15min、过滤除去活性炭后,利用DEAE-52阴离子交换柱分离,收集水洗分离组分,再利用Sephadex-G交联葡聚糖凝胶层析纯化,最后通过冷冻干燥获得10g鲍鱼肌肉多糖,纯度为92%。

7、采用苯酚-硫酸法,以半乳糖作为标准品进行检测鲍鱼肌肉多糖的总糖含量;采用凯氏定氮法测量蛋白含量;单糖组成采用高效液相色谱法测定;多糖结构采用核磁共振(NMR)进行分析;多糖对肿瘤细胞的抑制作用通过四唑盐(MTT)比色法进行检测。

实施例2

1、1kg的鲍鱼肌肉去除表面杂质后,与2L冷水混合搅碎,然后在20℃恒温箱里搅拌萃取30min,通过5000rpm离心30min除去不溶物后,获得2.5L的上清液。

2、将步骤1获得的上清液用氢氧化钠调整pH至9.0,然后先后加入5.0g碱性蛋白酶和5.0g胶原酶,在45℃下酶解1h。

3、用盐酸将步骤2获得的上清液的pH调整至6.0,再分别加入5.0g中性蛋白酶和5.0g木瓜蛋白酶,在45℃下酶解1h。

4、酶解结束后,通过旋蒸浓缩至0.4L,往浓缩液中加入0.1L的无水酒精,于常温下静置60min后,过滤除去沉淀。

5、在步骤4获得的滤液中继续缓慢添加1.5L的无水酒精,放在4℃下静置16h可以获得60g左右的沉淀物。

6、上述沉淀物用0.30L的蒸馏水溶解后,加入3g的活性炭,在35℃下脱色1h后,通过5000rpm离心30min、过滤除去活性炭后,利用DEAE-52阴离子交换柱分离,收集水洗分离组分,再利用Sephadex-G交联葡聚糖凝胶层析纯化,最后通过冷冻干燥获得11g鲍鱼肌肉多糖,纯度为92%。

7、采用苯酚-硫酸法,以半乳糖作为标准品进行检测鲍鱼肌肉多糖的总糖含量;采用凯氏定氮法测量蛋白含量;单糖组成采用高效液相色谱法测定;多糖结构采用核磁共振(NMR)进行分析;多糖对肿瘤细胞的抑制作用通过四唑盐(MTT)比色法进行检测。

实施例3

1、1kg的鲍鱼肌肉去除表面杂质后,与3L冷水混合搅碎,然后在30℃恒温箱里搅拌萃取30min,通过5000rpm离心25min除去不溶物后,获得3.5L的上清液。

2、将步骤1获得的上清液用氢氧化钠调整pH至9.0,然后先后加入1.75g碱性蛋白酶和1.75g胶原酶,在55℃下酶解3h。

3、用盐酸将步骤2获得的上清液的pH调整至7.0,再分别加入1.75g中性蛋白酶和1.75g木瓜蛋白酶,在55℃下酶解3h。

4、酶解结束后,通过旋蒸浓缩至0.3L,往浓缩液中加入0.13L的无水酒精,于常温下静置60min后,过滤除去沉淀。

5、在步骤4获得的滤液中继续缓慢添加0.77L的无水酒精,放在4℃下静置12h可以获得60g左右的沉淀物。

6、上述沉淀物用0.40L的蒸馏水溶解后,加入12g的活性炭,在40℃下脱色1h后,通过5000rpm离心25min、过滤除去活性炭后,利用DEAE-52阴离子交换柱分离,收集水洗分离组分,再利用Sephadex-G交联葡聚糖凝胶层析纯化,最后通过冷冻干燥获得11.5g鲍鱼肌肉多糖,纯度为92%。

7、采用苯酚-硫酸法,以半乳糖作为标准品进行检测鲍鱼肌肉多糖的总糖含量;采用凯氏定氮法测量蛋白含量;单糖组成采用高效液相色谱法测定;多糖结构采用核磁共振(NMR)进行分析;多糖对肿瘤细胞的抑制作用通过四唑盐(MTT)比色法进行检测。

鲍鱼肌肉多糖组成及结构分析

上述3个实施例提取的鲍鱼肌肉多糖总量、蛋白含量及单糖组成如表1所示:

表1鲍鱼肌肉多糖的化学组成和单糖组成

根据表1的结果,3个实施例提取的鲍鱼肌肉多糖中的蛋白含量都低于1%,总糖含量都接近90%,而且以摩尔比例计算,该鲍鱼肌肉多糖含有99%以上的D-葡萄糖,表明本发明提取的鲍鱼肌肉多糖可能是一种葡聚糖。另外,提取的鲍鱼肌肉多糖的分子量大约为3200Da(数据未显示)。

将鲍鱼肌肉多糖甲基化,甲基化前后产物的红外光谱结果如图1所示,甲基化后的红外光谱在3400cm-1附近没有出现峰,说明鲍鱼肌肉多糖甲基化完全。对甲基化产物进行气相色谱分析,结果如表2所示:

表2鲍鱼肌肉多糖甲基化产物分析

由表2可知,葡萄糖Glc检测出以下四种键型:1→,1→4,1→6,1→4,6;甘露糖(Man)检测出了一种键型:1→2。与单糖结果类似,鲍鱼肌肉多糖也检测到少量的支链(1→2)Man,因此理论上可以认为所提取的鲍鱼肌肉多糖是由D-葡萄糖组成的葡聚糖。

鲍鱼肌肉多糖的结构特征通过1D和2D NMR图谱确定,如图2所,1H-NMR图谱的异头氢区域分别观察到δ5.35(d, 3JH-1,H-2=4.13Hz),5.33(没有分裂峰),5.24(d,3JH-1,H-2=4.00Hz),4.98ppm(d,3JH-1,H-2=4.13Hz)四个异头氢信号,表明鲍鱼肌肉多糖的糖残基是通过α-构型的糖苷键连接。

从图3的13C NMR图谱中可以观察到δ102.83,101.39,100.76,98.58和94.69ppm五个异头碳信号,但在图4的HSQC图谱的异头区只观察到了四个主要的交叉峰。因此可以认为鲍鱼肌肉多糖是由四个糖残基组成,对应的异头区信号分别为δ5.35/102.83(残基A),5.33/100.76(残基B),5.24/94.68(残基C)和4.98/101.63ppm(残基D)。图3的13C NMR图谱还可以说明鲍鱼肌肉多糖是一种吡喃糖。另一方面,由图2中异头氢信号的信号强度以及甲基化的结果可以将残基A,B,C,D暂时归属为→4)-α-D-Glc-(1→,→4,6)-α-D-Glcp-(1→,→6)-α-D-Glcp-(1→和T-α-D-Glcp-(1→。

根据图4的HSQC谱图,图5的COSY谱图和图6的TOCSY谱图的结果及文献中的数值对1H NMR和13C NMR中的信号进行归属,结果如表3所示:

表3鲍鱼肌肉多糖的COSY,TOCSY和HSQC谱峰的归属

由表3中的数据可以看出,13C NMR图谱中的信号值80.80和80.87ppm分别属于残基A和残基B的4位碳,表明残基A和残基B的4位碳发生了取代。同样的,残基B和残基C的6位碳也发生了取代。由此进一步证明对残基A,B,C,D的归属是合理的。此外,在甲基化的结果中有检测到鲍鱼肌肉多糖中含有糖残基→2)-Man-(1→,但是在核磁分析结果(图2、图3)中没有检测到它的信号,这可能是因为鲍鱼肌肉多糖中的甘露糖含量太低的缘故。

从图7中可以观察到鲍鱼肌肉多糖残基A的H-1(δ5.35ppm) 和C-4的交叉峰(A H-1/A C-1),残基B的H-4(δ3.66ppm)和残基A的C-1的交叉峰(B H-4/A C-1),残基B的H-1(δ5.33ppm)和残基A的C-4的交叉峰(B H-1/A C-4),表明残基A和残基A以及残基A和残基B之间都是通过1,4-糖苷键进行连接。

从图8中可以观察到鲍鱼肌肉多糖残基A的H-1(δ5.33ppm)和残基C的H-6的交叉峰(A H-1/C H-6),残基D的H-1(δ4.98ppm)和残基B的H-6的交叉峰(D H-1/B H-6),表明鲍鱼肌肉多糖中的糖残基A和残基C以及残基D和残基B之间都是以1,4-糖苷键进行连接。交叉峰A H-1/A H-4和A H-1/B H-4同样可以在ROESY图谱中观察到。

基于以上所有的化学及光谱分析结果,可以推断出从鲍鱼肌肉中获得的α-葡聚糖的一个可能的分子结构如图9:在鲍鱼肌肉多糖结构的一个循环单元中,主链上包含八个1→4糖苷键和一个1→6糖苷键,三条侧链通过1→6糖苷键与主链相连。

鲍鱼肌肉多糖对人体乳腺癌细胞和肝癌细胞的抑制分析

图10和图11为鲍鱼肌肉多糖对人体乳腺癌细胞(MDA-MB-231细胞)和人体肝癌细胞(HepG2细胞)生长抑制的影响,结果表明提取的鲍鱼肌肉多糖对两种肿瘤细胞的生长抑制作用都有抑制效果和明显量效关系,可以应用在治疗乳腺癌和肝癌药品和保健品中。

以上所述仅为举例性,而非为限制性者。任何未脱离本发明之精神与范畴,而对其进行之等效修改或变更,均应包含于后附之申请专利范围中。

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