一种高效杂交抗菌肽LI及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种高效杂交抗菌肽LI及其制备方法和应用。

背景技术：

抗菌肽是动物抵御外源病原体的第一道防线。它不仅具有杀灭病原菌的功能，还可以抗真菌、病毒、寄生虫以及抗癌细胞等生物功能。抗菌肽具有独特的杀菌机制，使其成为最有前景的抗生素替代物。抗菌肽分子具有带正电荷的氨基酸，如精氨酸、赖氨酸和组氨酸以及具有疏水残基的疏水性氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。带有静正电荷的抗菌肽与带负电荷细菌细胞膜相互静电吸引，抗菌肽靠近细菌细胞，疏水性残基探入菌体细胞的脂质双分子层，使菌体细胞膜形成微孔或孔状结构，致使细胞内物质外流，从而导致细菌死亡。目前阻碍抗菌肽应用于医学、化妆品、食品及畜牧等行业的原因有以下两个方面：一、抗菌肽的毒性。天然抗菌肽具有较高的细胞毒性。寻找一种提高抗菌肽细胞选择性的设计方法势在必行。抗菌肽的细胞选择性是指抗菌肽对病原细菌具有杀灭功能而对正常动物体细胞没有毒副作用，表现出对细胞的选择性杀灭作用。抗菌肽的治疗指数是评价其细胞选择性的关键性指标。二、抗菌肽的生产成本。目前抗菌肽的制备主要是化学方法和基因工程两种方法。化学方法生产抗菌肽合成精准，但产量少，成本高。基因工程生产抗菌肽的方法正在试验过程中，工程菌的筛选以及基因表达过程的条件控制一直是制约该方法生产抗菌肽的主要因素。盲目的使用基因工程的方法表达抗菌肽，没有对抗菌肽的结构和功能以及体外试验进行全面的摸索，导致表达得到的抗菌肽大多活性不高，或者具有溶血等细胞毒性。

抗菌肽分子量最小，种类繁多，结构复杂。目前，已经有多种方法来研究抗菌肽的结构与功能之间的关系，例如，对天然抗菌肽进行改造及全新设计抗菌肽等研究方法。

技术实现要素：

基于以上不足之处，本发明提供一种高效杂交抗菌肽LI及其制备方法和应用，该抗菌活性高而细胞毒性低。

本发明所采用的技术如下：一种高效杂交抗菌肽LI，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、如上所述的一种高效杂交抗菌肽LI的制备方法包括如下步骤：

1)根据定点氨基酸片段截取方法，截取人源抗菌肽LL37第14-21位氨基酸残基和牛源抗菌肽Indolicidin第5-13氨基酸残基片段，将上述两个片段依次连接，获得LI抗菌肽；

2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂；将得到的肽树脂经过TFA切割后，初步得到多肽产品；然后经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。

2、如上所述的一种高效杂交抗菌肽LI，在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。

本发明通过截取天然抗菌肽LL37第14-21位氨基酸残基(GlyLysGluPheLysArgIleVal)和Indolicidin(In13)的特征氨基酸残基片段(LysTrpProTrpTrpProTrpArgArg)，杂交设计得到全新抗菌肽LI(GlyLysGluPheLysArgIleValLysTrpProTrpTrpProTrpArgArg-NH₂)。抗菌肽LL37是由人源hCAP18蛋白衍生的α螺旋抗菌肽，具有广谱的抗细菌、真菌、病毒等生物活性。Indolicidin是来源于牛中性粒細胞的一种富含色氨酸和脯氨酸的13个氨基酸的小肽。色氨酸是疏水性氨基酸，可与细菌表明的磷脂发生疏水性作用，破坏细菌的磷脂膜，从而产生生物学活性。二者均具有一定的溶血细胞毒性。国内外还未见利用二者特征片段杂交来研究抗菌肽结构与功能关系的报道。通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，该抗菌活性高而细胞毒性低，发现LI不但对大肠杆菌、绿脓杆菌、鸡沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、八种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。因而，综合来看，LI是一种具有较高应用价值的抗菌肽。

附图说明

图1为设计得到的抗菌肽的三维预测图；

图2为设计得到的抗菌肽的质谱图。

具体实施方式

下面根据说明书附图举例对本发明做进一步说明：

实施例1

人源抗菌肽LL37的氨基酸序列为：

牛源抗菌肽In13的氨基酸序列为：

Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg-NH2

1 5 10 13

根据定点氨基酸片段截取方法，截取人源抗菌肽LL37第14-21位氨基酸残基(GlyLysGluPheLysArgIleVal)和牛源抗菌肽In13第5-13氨基酸残基片段(LysTrpProTrpTrpProTrpArgArg)。

将上述两个片段依次连接，获得LI(GlyLysGluPheLysArgIleValLysTrpProTrpTrpProTrpArgArg-NH₂)抗菌肽。

实施例2

将上述两个抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：

1)抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；

抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图)与表一中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

表1抗菌肽的设计

实施例3

对设计并合成得到的抗菌肽通过体外抑菌和溶血活性试验进行比较检测；

抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/ml)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。

检测结果见表2。通过表2可以看出，LI对于革兰氏阴性和阳性菌表现出较强的抑菌活性，其抑菌活性大于LL37和In13.，说明通过杂合LL37和In13的特征氨基酸残基片段提高了抗菌肽的抑菌活性。

表2抗菌肽的抑菌和溶血活性

溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mlPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μl PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μl 0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。

检测结果见表2。溶血浓度越大，表明溶血活性越小；通过表2可以看出，LI在检测范围内均没有溶血活性，而LL37和In13均表现出一定的溶血活性。

以上结果显示，截取人源抗菌肽LL37和牛源抗菌肽Indolicidin两个特征片段并依次连接所获得的抗菌肽LI具有更高的抗菌活性，并且对血细胞没有毒性。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的细胞选择性。由表2可以看出，LI具有较高的治疗指数，表明设计得到的LI抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。

<110> 东北农业大学

<120>一种高效杂交抗菌肽LI及其制备方法和应用

<160> 1

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Lys Glu Phe Lys Arg Ile Val Lys Trp

1 5 10

Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg-NH2

11 15 17