一种产油微藻一体式培养反应器及培养方法与流程

本发明涉及可再生生物能源技术领域，尤其涉及一种产油微藻一体式培养反应器，还涉及一种培养方法。

背景技术：

生物柴油指的是动、植物或微生物油脂经酯化反应后得到的长链脂肪酸烷基单酯。由于具有清洁、可再生、对环境友好的特性，生物柴油已日益受到欧美及亚洲一些能耗大国的重视并获得了长足的发展。

随着人们生活水平的提高，对能源的消耗日益增加，在2050年，全球的能源消耗量将达到现今的两倍。在化石能源消耗殆尽的情况下，人们纷纷把目光投向了生物能源，生物能源是解决能源问题的关键。它是清洁能源的代表，不但有极好的可循环性，并且环境友好，绿色清洁，生物能源的开发、利用将有效的为社会发展提供动力，并且带动其他相关产业，如运输、发电、以及相关的制造业，生物能源中的微藻柴油也正因此再次得到了人们的重视。

从目前国内外的技术水平来看，要实现微藻炼油的产业化，还需解决如下的技术难题：

①选育产油率高、生长速度快的微藻；

②开发工业化培养微藻的低成本生产装置。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决上述技术问题，进而提供一种产油微藻一体式培养反应器，体积小，适用于规模地培养和收集优质的产油微藻，可以为今后的大规模量产提供最可靠的资料，拥有灵活性强，易于改造等各种的特性。

本发明的技术方案：

一种产油微藻一体式培养反应器，包括：第一培养器、第二培养器、第一搅拌电机、第二搅拌电机、循环水泵、微藻采收器、第一搅拌桨叶、第二搅拌桨叶；所述第一搅拌桨叶设置于所述第一培养器内，并由所述第一搅拌电机驱动旋转，所述第二搅拌桨叶设置于所述第二培养器内，并由所述第二搅拌电机驱动旋转；所述第二培养器的上方设置有种子进料口，所述第一培养器的上方设置有培养基进料口；所述第一培养器与第二培养器连通，所述微藻采收器设置在所述第一培养器下方，用于接收所述第一培养器内产生的微藻。

进一步地，所述第一培养器的外侧设置有第一水浴加热套，所述第二培养器的外侧设置有第二水浴加热套，所述第一水浴加热套、第二水浴加热套通过第一循环水管道和第二循环水管道连通，所述第一循环水管道、第二循环水管道之间设置有所述循环水泵。

进一步地，所述第一培养器、第二培养器内分别设置有溶氧计和PH检测计。

进一步地，在所述第一培养器和第二培养器连通的管路上设置有电动阀门。

进一步地，所述第一培养器的下方设置有第一采样口、微藻出口，所述第二培养器的下方设置有第二采样口。

本发明具有以下有益效果：本发明公开的产油微藻一体式培养反应器，首先关闭反应器各电动阀门，将培养基和种子打入第二培养反应器中，通过调整第二培养反应器的温度，通过温度计测定第二培养反应器温度，使第二培养反应器达到高密度培养最佳培养温度。通过给第二培养反应器中通入空气，并且监控培养基中溶氧量，通过第二搅拌桨叶使微藻均匀和充分溶氧。当培养一定时间后，打开电动阀门进行采样，采完样品关闭电动阀门，测定样品吸光度，确定达到足够的微藻密度。打开电动阀门，使经高密度培养后的微藻进入第一培养反应器进行继续培养。当培养一定时间后，打开电动阀门从采样口进行采样，采完样品关闭电动阀门，测定样品吸光度，确定微藻油脂富集达到一定程度，打开电动阀门，将油脂富集后的微藻排入微藻采收器中。

本发明还提供一种培养方法，包括如下步骤：

第一步，准备实验设备与材料；

第二步，微藻的富集培养，培养后续油脂累积实验所需要的藻源；

第三步，油脂积累；

第四步，微藻生物量及油脂测定。

进一步地，所述实验设备包括光照培养箱、超低温保存箱、冷冻干燥机、离心机、分光光度计、超净工作台、蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱、自动控温摇床。

进一步地，包括光照培养箱培养和异养无光照培养，在光照培养箱中的光暗周期为15h:9h。

进一步地，所述油脂积累采用的培养基为BG培养基。

采用本发明的培养方法，工艺灵活，适应范围广，可以灵活的变换两段中的营养供给以及环境设置，这些灵活的方式可以适应不同种类的微藻以及其它微生物，生物能源的生产和废源资源化相结合，在生成生物柴油的同时对水处理中的很多不易降解的小分子有机物产物进行降解，为水处理提供便利。

本发明的有益效果将通过下面具体实施方式的描述变得更加明显。

附图说明

图1是本发明实施例的结构示意图；

图2是本发明实施例的生长曲线图；

图中1-第一培养器；2-第二培养器；3-第一搅拌电机；4-第二搅拌电机；5-循环水泵；6-微藻采收器；7-第一搅拌桨叶；8-第二搅拌桨叶；9-第一水浴加热套；10-第二水浴加热套；11-第一循环水管道；12-第二循环水管道；13-溶氧计；14-PH检测计；15-电动阀门；16-第一采样口；17-微藻出口；18-第二采样口。

具体实施方式

本实施例公开的产油微藻一体式培养反应器，包括

第一培养器1、第二培养器2、第一搅拌电机3、第二搅拌电机4、循环水泵5、微藻采收器6、第一搅拌桨叶7、第二搅拌桨叶8；第一搅拌桨叶7设置于第一培养器1内，并由第一搅拌电机3驱动旋转，第二搅拌桨叶8设置于第二培养器2内，并由第二搅拌电机4驱动旋转；第二培养器2的上方设置有种子进料口，第一培养器1的上方设置有培养基进料口；第一培养器1与第二培养器2连通，微藻采收器6设置在第一培养器1下方，用于接收第一培养器1内产生的微藻。

优选地，在第一培养器1的外侧设置有第一水浴加热套9，第二培养器2的外侧设置有第二水浴加热套10，第一水浴加热套9、第二水浴加热套10通过第一循环水管道11和第二循环水管道12连通，第一循环水管道11、第二循环水管道12之间设置有循环水泵5。

进一步地，第一培养器1、第二培养器2内分别设置有溶氧计13和PH检测计14。

具体地，在第一培养器1和第二培养器2连通的管路上设置有电动阀门15。

更加具体地，第一培养器1的下方设置有第一采样口16、微藻出口17，第二培养器2的下方设置有第二采样口18。

本发明实施例的工作原理如下：

首先关闭所有电动阀门15，用培养基进料泵通过第二培养器2培养基进料口将培养基打入第二培养器2中，然后用种子进料泵通过种子进料口将产油微藻种子打入第二培养器2中。循环热水通过第二水浴加热套10进口进入，通过第二水浴加热套10出口出水，从而升高高密度第二培养器2的温度，通过温度计测定第二培养器2温度，使第二培养器2达到高密度培养最佳培养温度。通过曝气蠕动泵和曝气头给第二培养器2中通入空气，并且通过溶氧计13监控培养基中溶氧量，通过第二搅拌桨叶8使微藻均匀和充分溶氧，通过pH检测计14监测培养基酸碱度。当培养一定时间后，打开电动阀门15从采样口进行采样，采完样品关闭电动阀门15，测定样品吸光度，确定达到足够的微藻密度。打开电动阀门15，使经高密度培养后的微藻进入第一培养器1进行继续培养。当培养一定时间后，打开电动阀门15从采样口进行采样，采完样品关闭电动阀门15，测定样品吸光度，确定微藻油脂富集达到一定程度，打开电动阀门15，将油脂富集后的微藻排入微藻采收器6中。

本发明的培养方法包括如下步骤：

第一步，准备实验设备与材料；

第二步，微藻的富集培养，培养后续油脂累积实验所需要的藻源；

第三步，油脂积累；

第四步，微藻生物量及油脂测定。

具体地，本实施例的实验设备包括150C型数显光照培养箱；DW-50W255型-50℃超低温保存箱；LGJ-10D型冷冻干燥机；TDL-40B型离心机；T6型紫外/可见光分光光度计；SW-CJ-1G型超净工作台；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅；101-2AB型电热鼓风干燥箱；ATL-032LR型自动控温摇床；PHS-2C型PH计。

实验材料包括硝酸钠；磷酸氢二钾；硫酸镁；氯化钙；柠檬酸；柠檬酸铁铵；硼酸；氯化锰；硫酸锌；钼酸钠；硫酸铜；硝酸钴；葡萄糖；蛋白胨；可溶性淀粉；麦芽糖。

第二步，微藻的富集培养

微藻的富集工作是为了培养后续油脂累积实验所需要的藻源。按照实验需求分为光照培养箱培养和异养无光照培养两种形式。在光照培养箱中的光暗周期为15h:9h,每天早晚需将烧瓶摇匀。暗培养箱则不需要任何的光照。为了防止各类细菌污染，培养用工具器皿都要进过高温灭菌。定期用显微镜观察藻种情况，确定生长状况以及是否存在污染。藻种的重新接种是为了保持藻种的新鲜程度，为油脂累积试验提供固定的年轻藻源。接种时通过测量吸光度和血球计数板确定接种密度，一般使用吸光度在1-2范围内、对数后期的藻源接种。接种体积为目标培养液体积的15％。

第三步，油脂积累

在油脂累积实验中，不同的培养条件有不同的操作参数。实验中所用的培养基仍为BG培养基，培养基的配置标准严格遵循中科院武汉水生所淡水藻库所提供的配方如表1所示。

表1BG培养基配方

同时，通过加入1M HCl或1M NaOH溶液的方式来调节pH值,使得试验中的培养液pH浓度在5到10之间。温度范围则设定在10℃到45℃之间。光照强度的设定范围从0lux到5000lux。实验中的微藻均在72小时后采样检测。

油脂累积实验中所用到的碳源有葡萄糖和模拟废碳源。

第四步，微藻生物量及油脂测定方法

微藻的生物量测定与含油量的测定是试验的关键。试验中对各个细节的掌握和熟练的操作可以确保数据的精确。

(1)微藻生物量的采收

试验中采用了离心法采收微藻，将生长到研究需要阶段的藻液转移到离心管中，放入离心机，在4000rpm的转速下离心5min，放弃上清液，将下层浓缩藻泥放入冰箱冷冻30min后转入冷冻干燥机中干燥24h。取出后保存在4℃的冰箱中备用。

(2)微藻生物量的测定方法

生物量的测定主要通过使用分光光度计的浊度法确定生物量，并且配合称重和吸光度值寻找最佳的生长量拟合曲线。

a.细胞干重法

取4mL藻液置于已称重的5mL离心管中，在5000-7000rpm转速下离心5min，去上清液。并放于烘干箱中在65℃下烘干至恒重。同时测量三个平行样，取平均值。

b.浊度法

使用紫外可见分光光度仪测量微藻溶液在波长为540nm下的吸光度(OD540)。用去离子水作为参比样测量在540nm时的吸光度。通过每天测得的吸光度绘制微藻的生长曲线。并对微藻的生长情况做出分析。

c.生长曲线的确定

生长曲线是将微藻溶液吸光度和干重相结合所得到的描述单一批次微藻生长状况的线。通过生长曲线我们可从吸光度的大小直接联系到藻液中含有藻量的干重，便于试验的进展。

细胞干重的测量方法是生物量计算的最直接方法，过程中需要涉及到离心，洗涤和干燥几个步骤。因为细胞浓度与干重之间存在着较好的正相关关系，所以我们可以建立一套标准曲线，通过对吸光度的测量间接得到样品中生物量的大小。这种计算方法也正是大多数的单细胞微藻研究中所惯用的手段。

在BG培养基、pH值自然、光照强度2000lux、接种量1:5、培养温度25℃的条件下培养，得到如图2所示的生长曲线。单细胞藻类在光合作用的过程中，需要一定的温度范围。温度的变化例如升温或者降温的时候会对光合作用有一定的促进或者抑制作用。有研究指出光合作用和呼吸作用的强度都会被温度所影响，而这两大支柱却都是和微藻的生长代谢有着紧密的关系。并且微藻属于生态热型微生物，它们必须从环境中得到热源，温度的大幅度变化会导致生长速率、新陈代谢效率和细胞内的生化反应速度巨变。因此培养时的温度是影响单细胞微藻生长的重要因素之一。微藻可以适应的温度往往在15℃-40℃之间。而且不同种类的微藻所适应的范围也有所不同。单细胞的绿藻微藻最适合的温度上限在36℃左右而最合适的温度应在25℃～32℃之间。

这组实验的目的是在确定的无光培养状态下，在其他因素稳定的条件里，寻找到最节能而且效率最高的的培养温度。实验中的温度变化分为20℃、25℃、30℃、27℃、32℃几个标准。光照为0lux；初始pH为6.8；摇速为160rpm；通气量为50mL/d；培养基为BG培养基；葡萄糖碳源浓度为1g/L，初始吸光度相同的条件下培养72h。

实验结果如下表2所示

表2不同温度下微藻的生长情况

通过上表所示，可以看出当培养温度在30℃时，吸光度(540nm)最大，也就是藻体浓度最大，所以微藻最适生长温度为30℃。

培养基中的初始pH值会影响微藻生长及新陈代谢等很多生化反应的一个重要因素，pH会干涉光合作用里二氧化碳的使用性，同时在呼吸作用中将会影响微藻利用有机碳源效率。并且因为pH可以影响细胞壁的渗透性能，从而会使得细胞对培养液中的营养离子的吸收和利用受到一定的影响。同时对新陈代谢的中间产物的重复利用和藻内毒性也会有一定影响。与温度和光照相同，最适合藻类生长的pH在不同藻种间各有不同。有研究指出，最适合微藻生长的pH在5到8之间，pH7是最合适的。还有研究指出，因为生长过程中微藻会因为二氧化碳的吸收使pH升高，所以最佳的初始pH应该为6左右。所以我们的研究将在pH5到10这个范围中考察C.protothecoides 3的生长情况。

所以本实验的目的是寻找到一个最适合C.protothecoides 3生长和油脂累积的pH值。实验中的pH变化分为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。光照为0lux；温度为25℃；摇速为160rpm；通气量为50mL/d；培养基为BG培养基；葡萄糖碳源浓度为1g/L，接种量1:5，初始吸光度相同的条件下培养72h。实验结果如下表3所示

表3微藻不同pH值条件下的生长情况

通过上表4所示，可以看出当初始pH值在5.5时，吸光度(540nm)最大，也就是藻体浓度最大，所以微藻最适生长的初始pH值为5.5。

初始接种影响藻种的繁殖速度，在BG培养基、初始pH自然、光照强度0lux、培养温度25℃、初始吸光度相同的条件下培养时间72h。

实验结果如下表4所示

表4微藻在不同接种量的情况下的生长情况

通过上表所示，可以看出当接种量在1:5时，吸光度(540nm)最大，也就是藻体浓度最大，所以微藻最适生长的接种量为1:5。

有机碳源的浓度对藻种生长速率有重要的影响，在BG培养基、pH值自然、光照强度0lux、接种量1:5、培养温度25℃、初始吸光度相同的条件下培养时间72h。

实验结果如下表5所示

表5微藻在不同培养基条件下的生长情况

通过上表所示，可以看出当培养基为BG+2g/LC6H12O6时，吸光度(540nm)最大，也就是藻体浓度最大，所以微藻最适生长的培养基为BG+2g/LC6H12O6。通过生长曲线可知吸光度为1.637，其藻体干重已经达到0.5以上。

综上所述，微藻最适生长条件为接种量1:5、初始pH值5.5、培养温度30℃和BG+2g/LC6H12O6培养基。

采用本发明的培养方法，工艺灵活，适应范围广，可以灵活的变换两段中的营养供给以及环境设置，这些灵活的方式可以适应不同种类的微藻以及其它微生物，生物能源的生产和废源资源化相结合，在生成生物柴油的同时对水处理中的很多不易降解的小分子有机物产物进行降解，为水处理提供便利。

以上实施例只是对本专利的示例性说明，并不限定它的保护范围，本领域技术人员还可以对其局部进行改变，只要没有超出本专利的精神实质，都在本专利的保护范围内。