一种可区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针及其制备方法、应用与流程

本发明涉及一种基于多信号模式区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针及其制备方法、应用，属于分析化学技术领域。

背景技术：

活性硫物质(RSS)，包括小分子生物硫醇(Thiols)和气体分子硫化氢(H2S)，是人体内起着重要生理作用的一类生物活性分子。半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是最常见的三种小分子生物硫醇，然而，它们有着截然不同的生物和药理作用，同时相互之间又存在着密切的联系。Cys是乙酰辅酶、牛磺酸和GSH的前体，同时还能与铁离子形成硫铁络合物，但是异常水平的Cys通常会引起生长缓慢、嗜睡、肝功能损伤、肥胖等疾病。过高浓度的Hcy则可能诱导心血管病和阿尔茨海默氏症，在血浆中Hcy的总浓度还与某些先天性疾病和老年认知障碍有关。GSH是细胞中浓度最大的非蛋白硫醇(1-10mM)，以还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式存在。它参与了众多生理活动，例如氧化还原反应、异物代谢、信号传导与基因调控等，在细胞生长和维持细胞氧化还原平衡上起着关键作用。GSH还是一种抗氧化剂，可以保护巯基蛋白和酶免遭氧化，维持活性。然而，浓度异常的GSH往往与癌症、阿尔茨海默氏症和心血管等疾病有关。H2S是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被发现的第三种内源性信号气体分子，在心血管和神经系统中承担着重要的生理调节作用，例如调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等。若细胞中H2S浓度发生异常，可能会引起高血压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。因此，发展能区分识别硫醇(Cys/Hcy/GSH)和硫化氢(H2S)的荧光探针对研究生命体系中硫醇之间及硫醇与H2S的生理联系和它们的生理功能意义重大，也有助于探索与Cys/Hcy/GSH和H2S相关疾病的发生发展机制以及研发治疗相关疾病的药物。

近年来，由于小分子有机荧光探针具有高选择性、高灵敏度、操作方便、无创性检测等优点，从而受到了包括生命科学、医学、药理学、分析化学等各个领域的广泛关注。特别是在分析检测生物样品中，荧光探针更能体现出其优势。荧光探针能对生物样品中目标分子进行非侵入性成像检测，可以实时观察到荧光探针识别目标分子前后的光学信号变化，并且能将这些信号转化为具体的图片信息。目前，虽然报道了大量的Cys/Hcy、GSH和H2S荧光探针，但它们还无法同时将Cys/Hcy、GSH和H2S区分检测开来。所以，发明能同时、快速区分检测Cys/Hcy、GSH和H2S的易观查信号变化的荧光探针是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明通过分子设计，合成出了一种区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针，简称HMN，其是基于多信号模式区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的；本发明还进一步提供了该探针HMN的制备方法和应用。

本发明采用以下技术方案：

一种可区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针，该探针的分子式为：C38H28IN5O5S，其结构式如下所示：

上述的可区分检测半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽和硫化氢的荧光探针的制备方法，它包括以下步骤：

1)将1.0mmol原料羟基吲哚、2.0mmol苄基溴和2.0mmol碘化钾置于圆底烧瓶中，滴加乙腈使反应物完全溶解，将反应液加热至回流，搅拌反应6小时，反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品，并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物2；

所述化合物2的结构式为：

2)取0.2mmol化合物2和0.2mmol苯并噻唑(HBTQ)置于圆底烧瓶中，滴加乙醇使反应物完全溶解，将反应加热至回流，搅拌4小时，反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品，并用硅胶层析柱纯化得到纯净化合物HBTMC；

所述化合物HBTMC的结构式如下：

3)取0.1mmol化合物HBTMC、0.12mmol 4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑和0.1mmol碳酸铯置于圆底烧瓶中，滴加二氯甲烷使之完全溶解，在氮气保护和常温下搅拌反应2小时，待反应完毕，通过旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的溶剂得到粗产品，并用硅胶层析柱纯化得到纯净目标探针化合物HMN。

所述步骤1)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比为50:1。

所述步骤2)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比为20:1。

所述步骤3)中硅胶层析柱纯化所用洗脱剂为二氯甲烷与乙醇体积比为25:1。

上述的荧光探针的合成路线如下：

本发明基于多信号模式区分检测Cys/Hcy、GSH和H2S荧光探针的用途：通过荧光光谱仪测试在水溶液中由Cys/Hcy、GSH和H2S引起荧光探针HMN的荧光光谱变化来区分检测水环境中的Cys/Hcy、GSH和H2S；或者通过共聚焦显微镜对孵育了荧光探针HMN和Cys/Hcy、GSH和H2S的活细胞进行荧光成像，观察蓝色、绿色和红色通道荧光信号的变化以达到区分检测生物环境中的Cys/Hcy、GSH和H2S的目的。

本发明的优点：(1)探针合成简单，并且产率较高；(2)本发明实现了水溶液中Cys/Hcy、GSH和H2S的区分检测；(3)本发明实现了活细胞水平中Cys/Hcy、GSH和H2S的区分检测。

附图说明

图1是实施例1中化合物2的¹H NMR图谱；

图2是实施例1中化合物2的¹³C NMR图谱；

图3是实施例1中化合物HBTMC的¹H NMR图谱；

图4是实施例1中化合物HBTMC的¹³C NMR图谱；

图5是实施例1中探针HMN的¹H NMR图谱；

图6是实施例1中探针HMN的¹³C NMR图谱；

图7是实施例1中探针HMN随不同量Cys、Hcy、GSH和H2S的加入荧光谱图的变化情况；图中，Cys、Hcy和GSH浓度依次为0、10、30、50、70、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、650、800、1000μmol/L，H2S的浓度依次为0、10、30、50、70、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000μmol/L；

图8是实施例3中探针HMN与Cys、Hcy、GSH和H2S随时间变化的485、546和609nm处荧光强度值变化图；

图9是实施例4中探针HMN对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；图中，1，空白；2，丙氨酸；3，精氨酸；4，天冬氨酸；5，谷氨酸；6，异亮氨酸；7，苯丙氨酸；8，丝氨酸；9，苏氨酸；10，色氨酸；11，缬氨酸；12，组氨酸；13，抗坏血酸钠；14，醋酸钠；15，溴化钾；16，氯化钠；17，硝酸钠；18，亚硝酸钠；19，迭氮化钠；20，亚硫酸钠；21，硫代硫酸钠；22，氯化亚铜；23，氯化钙；24，氯化亚铁；25，氯化铁；26，氯化锌；27，次氯酸钠；28，过氧化钾；29，过氧化氢；30，过氧化叔丁醇；31，一氧化氮；32，Cys；33，Hcy；34，GSH；35，H2S(LC)；36，H2S(HC)；

图10是实施例5中探针HMN与HeLa细胞中Cys、Hcy、GSH和H2S响应的荧光成像图；图中，(a)是加入5μM探针HMN孵育30分钟后的荧光成像，(b)是先加入0.5mmol/L NEM孵育30分钟，随后加入5μM探针HMN继续培育30分钟后的荧光成像；(c-e)是先加入0.5mmol/L NEM孵育30分钟，随后加入0.2mmol/L Cys、Hcy或2.0mmol/L Na2S并孵育20分钟，最后再加入5μM探针HMN继续培育30分钟后的荧光成像；第一列至第三列分别为蓝色、绿色和红色通道荧光成像，第四列为蓝色、绿色、红色通道成像和明场成像叠加图；蓝色、绿色和红色通道荧光成像的激发波长分别为405、488和561nm，标尺为20微米。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1

化合物2的合成：

将175mg羟基吲哚(1.0mmol)，342mg(2.0mmol)苄基溴和232mg碘化钾(2.0mmol)置于圆底烧瓶中，加乙腈使反应物完全溶解，将反应液加热至回流，搅拌反应6小时。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂除去得到粗产品，以体积比为50:1的二氯甲烷与乙醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到252mg深褐色固体(产率64％)。¹H NMR(400MHz,CD3OD),δ(ppm):1.64(s,6H),5.77(s,2H),6.91-6.94(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.136-7.142(d,J＝2.4Hz,1H),7.37-7.38(2H),7.42-7.48(3H),7.56-7.58(d,J＝8.8Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CD3OD):δ(ppm):14.61,22.80,51.04,54.46,111.01,115.79,117.43,127.81,129.15,129.74,132.73,133.52,144.61,159.66,197.29.

化合物HBTMC的合成：

取51mg化合物HBTQ(0.2mmol)和79mg化合物2(0.2mmol)置于圆底烧瓶中，加乙醇使反应物完全溶解，将反应液加热至回流，搅拌反应4小时。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂除去得到粗产品，以体积比为20:1的二氯甲烷与乙醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到86mg暗红色固体(产率68％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):1.86(s,6H),5.99(s,2H),6.91(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.27-7.26(2H),7.36-7.44(m,5H),7.48-7.52(t,J＝7.2Hz,1H),7.60-7.62(2H),7.70-7.74(d,J＝16.8,1H),8.11-8.13(d,J＝8.0Hz,1H),8.18-8.22(1H),8.24-8.37(dd,J＝8.8,2.0Hz,1H),8.60-8.64(d,J＝16.0Hz,1H),8.99-9.00(d,J＝2.0Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ(ppm):14.49,26.44,52.47,63.44,110.57,111.07,116.24,117.08,118.55,120.09,122.65,125.80,127.32,128.91,129.78,132.85,133.38,134.42,135.29,146.64,151.79,152.69,159.80,161.07,163.74,180.02。

化合物HMN的合成：

取63mg化合物HBTMC(0.1mmol)、24mg NBD-Cl(0.12mmol)和33mg碳酸铯(0.1mmol)置于圆底烧瓶中，加二氯甲烷使反应物完全溶解，在氮气保护和常温下搅拌反应2小时。待反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂除去得到粗产品，以体积比为25:1的二氯甲烷与乙醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化，得到35mg蓝色固体(产率44％)。¹H NMR(400MHz,CDCl3),δ(ppm):1.85(s,6H),5.65(s,2H),6.52-6.55(d,J＝11.2Hz,1H),6.81-6.83(d,J＝8.4Hz,1H),6.96-6.99(d,J＝14.4Hz,1H),7.34-7.37(2H),7.41-7.50(7H),7.86(s,1H),7.93-7.95(d,J＝8.4Hz,1H),8.05-8.07(d,J＝7.6Hz,2H),8.44-8.47(d,J＝11.2Hz,1H),8.67-8.69(d,J＝8.4Hz,2H),8.86(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm):14.47,27.59,50.13,110.59,113.52,116.34,121.80,122.24,124.30,126.25,127.28,128.42,129.60,130.92,135.68,135.99,136.22,140.80,144.33,144.86,145.83,151.07,151.98,153.19,153.58,163.47,175.55。

实施例2

探针HMN与不同当量Cys/Hcy、GSH和H2S反应的荧光光谱变化

取实施例1制备的探针HMN溶于乙腈中，制成浓度为1.0mmol/L探针母液(探针HMN的浓度为1.0mmol/L)；将Cys/Hcy、GSH和H2S加入蒸馏水，配制成浓度为5mmol/L的Cys/Hcy、GSH和H2S母液。从探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入不同当量的Cys/Hcy、GSH(0-100eq)和H2S(0-500eq)母液，用0.57mL乙腈和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含20％乙腈的测试溶液。用荧光光谱仪测试探针与不同当量的Cys/Hcy、GSH(0-100eq)和H2S(0-500eq)反应液的荧光光谱变化(激发波长分别为410、470和550nm)，荧光光谱变化情况如图7所示。由图7可见，随着Cys或Hcy加入当量的逐渐增加，当用410nm光源激发时，探针HMN溶液在485nm处的荧光峰值不变；当用470或550nm光源激发时，在546和609nm处的荧光峰值逐渐增加。随着GSH加入当量的逐渐增加，当用410或550nm光源激发时，探针HMN溶液在485和546nm处的荧光峰值不变；当用550nm光源激发时，在609nm处的荧光峰值逐渐增加。随着H2S加入当量的逐渐增加，当用410nm光源激发时，探针HMN溶液在485nm处的荧光峰值不变，而单量达到50后，荧光峰值开始增加；当用470nm光源激发时，探针HMN溶液在546nm处的荧光峰值一直不变；当用550nm光源激发时，探针HMN溶液在609nm处的荧光峰值逐渐增加，而单量达到50后，荧光峰值开始减弱。当荧光强度达到最大值时，加入Cys/Hcy后在546和609nm处的荧光强度比探针空白液分别增强53.4/57.6和32.2/32.9倍；加入GSH后在609nm处的荧光强度比探针空白液增强33.6倍；加入H2S后在485和609nm处的荧光强度比探针空白液分别增强52.7和17.7倍。

实施例3

探针HMN与Cys/Hcy、GSH和H2S随时间变化的荧光变化

从实施例2探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入不同当量的Cys/Hcy(55eq)、GSH(65eq)和H2S(50或500eq)母液，用0.57mL乙腈和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含20％乙腈的测试溶液。分别用410、470和550nm的激发波长，测试探针随时间变化的荧光光谱。由图8可见，随着时间增加，加入Cys/Hcy后，在485和609nm处的荧光强度逐渐变大，并且分别在12/20和15/20min左右达到最大值；加入GSH后，在609nm处的荧光强度逐渐变大，并且在20min左右达到最大值；加入50eq H2S后，在609nm处的荧光强度逐渐变大，并且在4min左右达到最大值；加入500eq H2S后，在485nm处的荧光强度逐渐变大，并且在2min左右达到最大值。

实施例4

探针HMN对不同干扰分析物的选择性研究

从实施例2中荧光探针母液中取出30μL加入到5mL的离心管当中，分别加入以下不同浓度的分析物：1.0mmol/L的丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、组氨酸、抗坏血酸钠、醋酸钠、溴化钾、氯化钠、硝酸钠、亚硝酸钠、迭氮化钠、亚硫酸钠、硫代硫酸钠、氯化亚铜、氯化钙、氯化亚铁、氯化铁、氯化锌、次氯酸钠、过氧化钾、过氧化氢、过氧化叔丁醇和一氧化氮，0.6mmol/L的Cys、Hcy和GSH，0.5mmol/L的H2S，5.0mmol/L的H2S，用0.57mL DMF和不同体积的PBS水溶液(浓度25mmol/L，pH 7.4)稀释至3mL，配置成探针浓度为10μmol/L，含20％乙腈的测试溶液。反应20分钟后检测测试液的荧光光谱变化。由图9可以发现，相对于空白测试液，当用410nm光源激发时，只有加入5.0mmol/L H2S的探针溶液在485nm处荧光峰值显著增加；当用470nm光源激发时，只有加入Cys和Hcy的探针溶液在546nm处荧光峰值显著增加；当用550nm光源激发时，只有加入Cys、Hcy、GSH和H2S(0.5mmol)的探针溶液在609nm处荧光峰值显著增加。而加入各种氨基酸、阴离子、金属离子、活性氧和活性氮的测试液，无论用410、470或550nm光源激发都没有引起探针溶液明显的荧光强度变化。实验结果说明探针HMN可以通过三个通道的荧光变化来区别其他干扰物，同时实现Cys/Hcy、GSH和H2S的区分识别。

实施例5

探针HMN与细胞中的Cys/Hcy、GSH和H2S荧光成像

为了证明探针HMN能区分识别细胞中的Cys/Hcy、GSH和H2S，一共做了五组细胞荧光成像实验。第一组：从实施例2中荧光探针母液中取出5μL加入到育有HeLa细胞的培养皿(含1mL PBS培养基)中，探针浓度为5μmol/L，孵育30分钟；第二组：将0.5mmol/L的N-乙基马来酰亚胺(NEM)加入到有HeLa细胞的培养皿中，孵育30分钟后加入5μmol/L探针HMN，并继续孵育30分钟；第三组：将0.5mmol/L的N-乙基马来酰亚胺(NEM)加入到有HeLa细胞的培养皿中，预先孵育30分钟，随后加入0.2mmol/L的Cys并孵育15分钟，最后再加入5μmol/L探针HMN，继续孵育30分钟；第四组：将0.5mmol/L的NEM加入到有HeLa细胞的培养皿中，预先孵育30分钟，随后加入0.2mmol/L的Hcy并孵育15分钟，最后再加入5μmol/L探针HMN，继续孵育30分钟；第五组：将0.5mmol/L的NEM加入到有HeLa细胞的培养皿中，预先孵育30分钟，随后加入2.0mmol/L的Na2S并孵育15分钟，最后再加入5μmol/L探针HMN，继续孵育30分钟。随后，用共聚焦显微镜分别对五组细胞进行荧光成像，使用激发波长为405、488和561nm的光源激发，收集465-500、525-555和595-630nm范围的荧光。结果如图10所示，在只加入探针的细胞组中，蓝色和绿色通道都没有荧光，而红色通道有很强的荧光，这应该是探针细胞中内源性的GSH作用的结果；在加入硫醇抑制剂NEM的细胞组中，无论是蓝色、绿色通道，还是红色通道几乎都观察不到荧光；然而，在加入Cys或Hcy的细胞组中，可以明显地观察到绿色和红色荧光；而加入H2S的细胞组中，绿色和红色通道都没有荧光，但是在蓝色通道能观察到较强的荧光。实验结果说明探针HMN可以通过共聚焦显微镜三通道荧光成像，实现区分检测细胞环境中的Cys/Hcy、GSH和H2S，具有潜在的实际应用价值。