microRNA检测探针组与microRNA的检测方法与流程

本发明涉及分子检测
技术领域：
，尤其涉及microRNA检测探针组与microRNA的检测方法。
背景技术：
：MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19-24个核苷酸的非编码单链RNA分子。由于miRNA能够很好的识别并配对后转录基因进而调控蛋白的表达，所以它与动物体内的生物过程息息相关。目前已经有研究表明：miRNA的异常行为会导致疾病的出现，包括心血管疾病，神经发育失常，甚至癌症[Nature,2012,482,347.]。例如miRNA-32的过表达是前列腺癌的基础的重要标志物[Oncogene2012,31,4460.]，miRNA-122也被作为肝癌细胞发病的一个基础标志物[J.Am.Chem.Soc.2010,132,7976.]。所以在癌症的诊断以及治疗过程中miRNA的浓度都是一个重要的生物指标。目前，通用的miRNA检测方法有qRT-PCR，Northernblot，寡核苷酸微阵列[Chem.Rev.,2013,113,6207.]，其中NorthernBlotting是最经典的miRNA检测手段，但是它本身检测灵敏度较低，并且需要大量的样品。而微阵列具有高通量检测的优势，但是检测需要的时间很长，并且精度不高。qRT-PCR检测手段具有高精度，高灵敏度的特点，但是需要长时间的扩增步骤并且对操作人员具有一定的技能要求，这在实时检测中是一个很大的问题。但是上述方法最大的一个问题是所有的实验都是基于细胞裂解处理，无法实时的反映出肿瘤组织及肿瘤细胞内部真实的miRNA的作用机制。因此为了能更加深入了解miRNA在细胞内调控基因表达的真实信息以及探索miRNA在细胞内的反应的动态过程，实现细胞内的miRNA的检测则尤为重要。现如今体内miRNA检测手段主要分为原位杂交技术和动态成像技术。在动态成像技术中基于分子信标成像是一个非常重要的手段。借助特殊的转染技术将荧光标记的分子信标导入细胞内，分子信标与目标miRNA分子配对后发生结构的转变会导致荧光信号的出现，最终实现miRNA的检测。[Biomaterials,2012,33,6430.]但是这些技术中存在一个明显的问题就是每次的信号分子的输出都伴随着目标分子的消耗。而在肿瘤细胞或肿瘤组织中的miRNA分子表达非常的有限，所以上述的技术在实现肿瘤组织活细胞内miRNA分子的检测具有很大的限制。因此，为了克服现有技术中细胞内miRNA分子检测的困难，本发明人进行了深入研究，发现利用级联的DNA链替换反应实现肿瘤细胞或组织内microRNA检测具有简单操作，可以实现低浓度检测等特点，但是，如何避免级联DNA链替换反应过程中发生的荧光信号的泄露现象，仍是本领域亟待解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供microRNA检测探针组与microRNA的检测方法，本发明提供的探针设置合理，能够有效避免荧光信号的泄露，提高检测的特异性。本发明提供的检测microRNA的探针组，由4条DNA探针组成，分别为：基底链、信号链、主导燃料链和保护燃料链；所述基底链包括顺序连接的淬灭基团、准粘性末端和待测microRNA的互补序列；所述信号链与基底链互补，所述信号链一端修饰有荧光基团；所述保护燃料链与待测microRNA互补；所述主导燃料链包括顺序连接的待测microRNA序列一致的DNA序列和互补准粘性末端。本发明的探针组中，淬灭基团位于基底链的3’端，则荧光基团位于信号链的5’端；淬灭基团位于基底链的5’端，则荧光基团位于信号链的3’端。本发明实施例中，淬灭基团位于基底链的5’端，而荧光基团位于信号链的3’端。本发明提供的探针组根据待测microRNA的序列设计。其中基底链与信号链部分互补、保护燃料链与主导燃料链部分互补。以本发明提供的探针组对待测miRNA进行检测的原理如图1：首先，将基底链与信号链杂交，使基底链与信号链形成双链A。形成双链后，信号链末端的荧光基团会与基底链末端的淬灭基团非常的靠近，荧光基团被淬灭，没有荧光信号的输出。然后，将主导燃料链和保护燃料链杂交，形成双链B。然后，将双链A和双链B在转染剂的作用下，转染入动物体(或人体)、组织或细胞中。当双链A和双链B进入生物体(或人体)、组织或细胞中，在盐离子的作用下，发生链替换反应，反应步骤为：一、待测miRNA首先与双链A上的裸露的一端作用，进而发生链替换反应，其中，待测miRNA与基底链形成中间体1；而信号链则被释放，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光信号；二、中间体1与双链B发生链替换反应，其中，miRNA与保护燃料链形成中间体2；而主导燃料链和基底链结合形成双链C，不再发光；三、中间体2与双链A发生链替换反应，其中，miRNA与基底链结合形成中间体1，而保护燃料链则与信号链结合，形成双链的信号链，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。在上述过程中，DNA链替换反应使得，信号链被释放为单链或者和与保护燃料链结合形成双链信号链，从而使得荧光基团得以发出荧光。而由于miRNA与保护燃料链形成中间体2后，仍然能够用于触发与双链A的反应，从而使得级联的DNA链替换反应不断发生，实现了荧光基团不断被释放，进而实现了荧光信号不断被放大。本发明充分利用了级联的DNA链替换反应在信号放大上的能力，最终实现了细胞内miRNA分子的检测。本发明提供的方法不再需要将miRNA从样品中分离，而是通过将探针转染入动物体(或人体)、组织或细胞中，通过对荧光信号的检测，实现了对体内，或细胞内miRNA分子的检测，从而能够更加深入了解miRNA在细胞内调控基因表达的真实信息以及探索miRNA在细胞内的反应的动态过程。为了避免探针在体外就发生链替换反应，本发明对4条探针的长度、准粘性末端的长度、互补序列的长度、荧光基团或淬灭基团的位置和种类进行了研究。本发明中，基底链顺序连接的淬灭基团、准粘性末端和待测microRNA的互补序列；信号链与基底链互补，信号链一端修饰有荧光基团。本发明中，基底链上准粘性末端的长度为4bp～5bp。优选的，基底链上准粘性末端的长度为5bp。本发明中，信号链未修饰荧光基团的一端比基底链短5bp～6bp。优选的，信号链未修饰荧光基团的一端比基底链短6bp。本发明中，淬灭基团为BHQ-1，Dabcyl或BHQ-2；所述荧光基团为FAM或Cy3，Cy-5。基底链上比信号链长出的部分是待测microRNA的互补序列。以互补序列形成裸露端，有利于链替换反应的发生，而实验表明，6bp的裸露端更有利于发生链替换反应，产生荧光的时间短且荧光值较高。在一些实施例中，基底链的5’端至3’端依次连接淬灭基团，准粘性末端、与待测microRNA的互补序列。其中，淬灭基团为BHQ-2；准粘性末端的长度为5bp，所述与待测microRNA的互补序列为与待测microRNA全长完全互补的DNA序列。所述准粘性末端的序列不使基底链产生二级结构，如发夹结构。在一些实施例中，信号链3’端至5’端依次连接荧光基团、互补准粘性末端和与待测miRNA序列一致的DNA序列。其中，荧光基团为Cy-5；互补准粘性末端的长度为5bp，互补准粘性末端与基底链上的准粘性末端完全互补；与待测miRNA序列一致的DNA序列与基底链上的相应片段部分互补，该片段与miRNA相比5’端缺少6bp。当待测miRNA与信号链和基底链形成的双链A发生链替换反应后，由miRNA与基底链形成的中间体1中，基底链上准粘性末端被暴露出来，形成裸露端。本发明实施例中，中间体1中的裸露端的长度为5bp。本发明中，所述保护燃料链与待测microRNA互补；所述主导燃料链的包括顺序连接的待测microRNA序列一致的DNA序列和互补准粘性末端。本发明中，保护燃料链的长度为14bp～15bp。优选的，保护燃料链的长度为14bp。优选的，保护燃料链上与待测microRNA互补的序列长度为13bp，在该序列的5’端添加一个碱基，以促使链替换反应的发生。本发明中，主导燃料链上的互补准粘性末端与所述基底链上的准粘性末端互补；所述主导燃料链上与待测microRNA序列一致的DNA序列长度为17bp～19bp。优选的，所述主导燃料链上与待测microRNA序列一致的DNA序列长度为18bp。本发明中，主导燃料链与保护燃料链形成双链B后，主导燃料链的3’端上的互补准粘性末端被裸露出来，该末端与基底链上的准粘性末端互补；主导燃料链的5’端裸露4bp。在反应过程中，中间体1中基底链裸露的准粘性末端与双链B中主导燃料链上裸露的互补准粘性末端结合，从而引导链替换反应的发生，基底链与主导燃料链结合形成双链C不再发光。而miRNA和保护燃料链则结合，形成中间体2。中间体2中，miRNA的5’端裸露9bp，该裸露部分可以与双链A中基底链裸露的部分互补，从而引导链替换反应继续进行。本发明通过合理设计DNA分子探针，使细胞内的待测miRNA能够触发级联的DNA链替换反应的发生，进而有效的释放具有荧光基团修饰的信号链，在有限的目标链的条件下，两条燃料链组成的双链B的存在能够最大限度的放大所释放的具有荧光基团修饰的信号链的数目，进而通过激光共聚焦显微镜或者小动物成像仪最终实现在细胞内或者肿瘤组织内miRNA的检测。且通过合理探针的设计，有效避免了荧光信号的泄露。且探针的设计巧妙的避免了链替换反应逆向发生，从而使得链替换反应一旦发生，便不再可逆，被释放出的信号链不会再与基底链结合。本发明提供的探针依靠链替换反应实现荧光信号的级联放大，由于链替换反应的发生条件并不复杂，在细胞、组织或生物体内广泛的发生。只要引物设计合理，链替换反应即可发生。因此，按照本发明提供探针组的形式设计探针，对不同序列的microRNA皆能够实现检测。该探针组能够广泛的应用于各种microRNA的检测。但探针中准粘性末端的长度、裸露端的长度、互补序列的长度可能影响荧光信号的产生。本发明提供的探针组基于级联的DNA链替换反应实现细胞内或者肿瘤组织内miRNA检测，特别是在miRNA分子低表达的细胞或者组织中具有非常好的优势。解决了在之前的检测技术中存在检测体系中信号分子输出中伴随着目标链损失的巨大困难。检测的范围也适用于其他类型的非编码RNA分子。同样该技术也是细胞以及其他组织成像中的一种重要手段。本发明提供的探针组能够用于活体动物体内microRNA的检测，也可用于培养的细胞内的microRNA的检测，也可用与离体组织中microRNA的检测。通过本发明提供的探针，根据转染后荧光产生的情况，能够实现对microRNA的绝对定量检测或相对定量检测，从而判断待测品中microRNA的表达情况。根据转染后荧光产生的位置，也可实现对microRNA分布情况的检测。并能够通过多次检测，实现对miRNA表达随时间的变化情况的检测。本发明提供的探针组在制备microRNA的细胞内检测的产品中的应用。由于现有技术中研究结果表明，多种miRNA的异常表达与癌症相关，故而本申请提供的探针组能够实现对肿瘤组织的成像，且能够根据成像情况、位置判断肿瘤发生的程度和位置。本发明提供的探针组在制备肿瘤组织成像的产品的应用。本发明还提供了一种microRNA的检测试剂盒，包括本发明提供的探针组。本发明提供的microRNA检测试剂盒中，还包括转染试剂。所述转染试剂为Lipofectamine2000。本发明提供的microRNA检测试剂盒中，还包括杂交缓冲液。所述杂交缓冲液为浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值为7.5。本发明提供的microRNA检测试剂盒中，基底链、信号链、主导燃料链和保护燃料链的摩尔比为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(2～4):(2～4)。本发明还提供了一种检测细胞内microRNA的方法，包括：步骤1：将本发明提供的探针组中，所述基底链与所述信号链杂交形成双链A；所述主导燃料链和保护燃料链杂交形成双链B；步骤2：将所述双链A与所述双链B转染待测细胞、组织或动物体后，成像。本发明提供方法中，基底链与信号链杂交的摩尔比为1∶1。杂交的缓冲液为浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值为7.5。基底链与信号链杂交的条件为：90℃保持15min，然后降温至室温，室温下保持不少于2h。优选的，室温为18℃～30℃。保持时间为2h。杂交后的双链A保存在4℃待用。本发明提供方法中，主导燃料链和保护燃料链杂交的摩尔比为1∶1。主导燃料链和保护燃料链杂交的条件为：90℃保持15min，然后降温至室温，室温下保持不少于2h。优选的，室温为18℃～30℃。保持时间为2h。杂交后的双链A保存在4℃待用。杂交获得双链A的浓度为10μmol/L；杂交获得双链B的浓度为20μmol/L。将杂交获得的双链A溶液和双链B溶液以体积比1:2混合后，加入转染试剂，然后以杂交缓冲液定容后，复合20min，制得转染溶液。转染溶液用于转染待测样品。其中，所述转染试剂为Lipofectamine2000。转染试剂的用量为双链B溶液体积的1/5。定容至终体积为双链B溶液体积的2倍。最终制得的转染溶液中，双链A的浓度为2.5μmol/L；双链B的浓度为10μmol/L。转染后，间隔0.5h～24h检测荧光信号。对于体外测试实验，转染后0.5h～2h荧光信号强度即可达到峰值。而对于注射转染的动物体，荧光信号需24h左右的时间，在肿瘤组织内富集达到峰值。转染动物体后，探针组一方面富集于肿瘤组织内，一方面经肾脏和肝脏代谢排出体外。主要经肾脏排出体外。本发明实施例中提供给了一种检测miRNA-21的探针组，由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4条DNA探针组成；其中，SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探针的5’端修饰淬灭基团；SEQIDNO:2所示核苷酸序列的探针的3’端修饰荧光基团。其中，SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探针为基底链；SEQIDNO:2所示核苷酸序列的探针为信号链；SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探针为主导燃料链；SEQIDNO:4所示核苷酸序列的探针为保护燃料链。本发明实施例证明，本发明提供的探针组合相对于其他设计方案而言，能够在较短时间内使荧光信号达到峰值，且荧光强度更强，荧光信号泄露现象被降低。miRNA-21的过表达与肿瘤密切相关，如乳腺癌、宫颈癌等。由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4条DNA探针组成探针组在制备肿瘤组织成像的产品的应用。所述肿瘤为乳腺癌。由MCF-7细胞系构建小鼠乳腺癌模型。miRNA-21检测试剂盒中包括由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4条DNA探针组成探针组、转染试剂和杂交缓冲液。所述转染试剂为所述转染试剂为Lipofectamine2000。所述杂交缓冲液为浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液。miRNA-21检测试剂盒中，基底链、信号链、主导燃料链和保护燃料链的摩尔比为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(2～4):(2～4)。本发明实施例还提供了一种肿瘤组织成像的方法，包括：步骤a：将SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的探针杂交形成双链A；将SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的探针杂交形成双链B；步骤b：将所述双链A与所述双链B转染待测组织或动物体后，成像。该实施例中，SEQIDNO:1所示基底链与SEQIDNO:2所示信号链杂交的摩尔比为1∶1。杂交的缓冲液为浓度为10mmol/L的Tris-HCl缓冲液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值为7.5。SEQIDNO:1所示基底链与SEQIDNO:2所示信号链杂交的条件为：90℃保持15min，然后降温至室温，室温下保持不少于2h。优选的，室温为18℃～30℃。保持时间为2h。杂交后的双链A保存在4℃待用。本发明提供方法中，SEQIDNO:3所示主导燃料链和SEQIDNO:4所示保护燃料链杂交的摩尔比为1∶1。SEQIDNO:3所示主导燃料链和SEQIDNO:4所示保护燃料链杂交的条件为：90℃保持15min，然后降温至室温，室温下保持不少于2h。优选的，室温为18℃～30℃。保持时间为2h。杂交后的双链A保存在4℃待用。杂交获得双链A的浓度为10μmol/L；杂交获得双链B的浓度为20μmol/L。将杂交获得的双链A溶液和双链B溶液以体积比1:2混合后，加入转染试剂，然后以杂交缓冲液定容后，复合20min，制得转染溶液。转染溶液用于转染待测样品。其中，所述转染试剂为Lipofectamine2000。所述转染试剂的用量与双链A的摩尔数或双链B的摩尔数相关。对于小鼠而言，定容体积(总溶液体积)为300μL时，双链A的体积为75μL(浓度为10μmol/L)，则转染试剂的用量为30μL。最终制得的转染溶液中，双链A的浓度为2.5μmol/L；双链B的浓度为10μmol/L。所述转染具体为将转染溶液通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内。转染后，间隔24h检测荧光信号。本发明提供了用于microRNA检测探针组与microRNA的检测方法，该探针组设计合理，利用链替换反应使得荧光信号得到级联放大，从而实现了对细胞内miRNA的检测。该方法无需严格的操作条件，操作简单，特别是在miRNA分子低表达的细胞或者组织中具有非常好的优势。解决了在之前的检测技术中存在检测体系中信号分子输出中伴随着目标链损失的巨大困难。实验表明，采用本发明提供的探针对miRNA进行检测，能够使荧光信号在1h左右达到最高，且最大程度避免了荧光信号泄露现象的产生。附图说明图1示本发明提供探针组的检测方法原理；图2示实施例1的实验结果；图3示实施例2的实验结果；图4示DNA分子探针在MCF-7肿瘤模型中的miRNA-21实施检测的小鼠组织器官成像图，其中，双链A浓度为2.5μM，双链B浓度为10μM；图5示DNA分子探针在MCF-7肿瘤模型中的miRNA-21实施检测的小鼠组织器官成像图；双链A浓度为2.5μM，双链B浓度为0μM；图6示DNA分子探针在MCF-7肿瘤模型中的miRNA-21实施检测的小鼠组织器官成像图；双链A浓度为0μM，双链B浓度为0μM；图7示DNA分子探针在MCF-7肿瘤模型中的miRNA-21实施检测综合图2、图3和图4中的小鼠肿瘤组织成像图。具体实施方式本发明提供了microRNA检测探针组与microRNA的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。所述完全互补是指两条链上的碱基数目相同，其中一条链由3’端至5’端与另一条链由5’端至3’端能够全部互补。所述部分互补是指除去末端多出的碱基，其余部分完全互补。所述序列一致是指除将U替换为T外，RNA的序列与DNA的序列一致。链替换反应即DNA链替换反应(stranddisplacementreaction)是指两条DNA链通过完全或者部分配对将先前已杂交的一条或者多条DNA链替换掉的过程。在链替换反应过程中，复合物(complex)上的单链DNA部分与侵入链(invadingDNA)上的单链DNA区域，通过碱基配对先结合在一起，然后经由分支迁移(branchmigration)向前无规行走从而将复合物上先前杂交的DNA链替换下来。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。本实验中所使用到的MCF-7的细胞购买于上海中科院细胞库。所有的初始原料，DNA都从生工(上海)生物工程股份有限公司或者Adamas公司购买，试剂除非说明都没有再次提纯。所有的化学试剂都是分析纯或者更高纯度的，使用的转染试剂是Lipofectamine2000(ThermoFisher)，胎牛血清购于ExCell公司。紫外可见分光光度计：Cary300。荧光分光光度计：F-7000(HitachiHigh-TechonologiesCorporationJapan)。荧光显微镜：IX71(OlymapusJapan)。激光共聚焦荧光显微镜：LeicaTCSSP5。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例11、荧光信号检测实验分为6组，其中：实验组1～3采用4条探针进行实验，而对照组1～3中仅含有3条探针(缺少保护燃料链)。实验探针设计如表1：各组探针中，信号链上的荧光基团位于3’端是FAM；基底链上的猝灭基团位于5’端是BHQ1。表1各组探针序列基底链信号链主导燃料链保护燃料链实验组1SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4对照组1SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3--实验组2SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7SEQIDNO:8对照组2SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7--实验组3SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12对照组3SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11--2、DNA探针的准备：1)、各探针分别溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液中，溶液中单链的浓度利用260nm波长紫外吸收值进行标定；2)、基底链与信号链等摩尔浓度混合，在90℃下保持15分钟，然后再逐渐降温至室温，保持室温进行退火，退火过程超过2小时。获得双链A，在4℃保存，浓度为100nM；3)、主导燃料链和保护燃料链等摩尔浓度混合，在90℃下保持15分钟，然后再逐渐降温至室温，保持室温进行退火，退火过程超过2小时。获得双链B，在4℃保存，浓度为400nM。4)、以10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)配制主导燃料链的溶液，浓度是20μM待用。3、反应动力学测试实验组：将4微升浓度为10μM的双链A，8微升浓度为20μM双链燃料链(双链B)，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液至总体积400微升。混合液杂交链浓度为100nM，燃料链浓度为400nM。对照组：将4微升浓度为10μM的双链A，8微升浓度为20μM单链的主导燃料链，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液至总体积400微升。混合液杂交链浓度为100nM，燃料链浓度为400nM。37℃，反应过程中，每隔一段时间用荧光分光光度仪扫描溶液荧光信号。选取FAM的吸收峰在518nm处的发射波长的荧光强度值为纵坐标，以时间为横坐标，绘制各组荧光强度随时间变化曲线。结果如图2，说明4条探针的组合更有利于降低荧光泄露情况的产生。实施例21、体外模拟miRNA-21的检测。配置miRNA-21(与miRNA-21序列相同的DNA单链)的标准液作为待测样品，浓度为10μmol/L。实验分为6组，其中：实验组1～3采用4条探针进行实验，而对照组1～3中仅含有3条探针(缺少保护燃料链)。实验探针设计如实施例1中表1：各组探针中，信号链上的荧光基团位于3’端是FAM；基底链上的猝灭基团位于5’端是BHQ1。2、DNA探针的准备：1)、各探针分别溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液中，溶液中单链的浓度利用260nm波长紫外吸收值进行标定；2)、基底链与信号链等摩尔浓度混合，在90℃下保持15分钟，然后再逐渐降温至室温，保持室温进行退火，退火过程超过2小时。获得双链A，在4℃保存，浓度为100nM；3)、主导燃料链和保护燃料链等摩尔浓度混合，在90℃下保持15分钟，然后再逐渐降温至室温，保持室温进行退火，退火过程超过2小时。获得双链B，在4℃保存，浓度为400nM。4)、以10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)配制主导燃料链的溶液，浓度是20μM待用。3、反应动力学测试实验组：将4微升miRNA-21标准液、4微升浓度为10μM的双链A，8微升浓度为20μM双链燃料链(双链B)，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液至总体积400微升。混合液杂交链浓度为100nM，燃料链浓度为400nM。对照组：将将4微升miRNA-21标准液、4微升浓度为10μM的双链A，8微升浓度为20μM单链的主导燃料链，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液至总体积400微升。混合液杂交链浓度为100nM，燃料链浓度为400nM。反应过程中，每隔一段时间用荧光分光光度仪扫描溶液荧光信号。选取FAM的吸收峰在518nm处的发射波长的荧光强度值为纵坐标，以时间为横坐标，绘制各组荧光强度随时间变化曲线。结果如图3，结果表明，SEQIDNO:1～4的探针组合能够在更短的时间内获得更高的荧光值。实施例31、肿瘤模型的建立：将MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左边腋下(小鼠为母鼠，约4周大小，重约20克)。大约移植2到3周时间可以进行实验。对模型小鼠体内miRNA-21进行检测，基底链序列(从左到右为5'—3')为：BHQ-2-CACAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDNO：1)；信号链的序列(从左到右为5'—3')为：ATCAGACTGATGTTGATTGTG-Cy5(SEQIDNO：2)；主导燃料链的序列(从左到右为5'—3')为：TTATCAGACTGATGTTGATTGTG(SEQIDNO：3)；保护燃料链的序列(从左到右为5'—3')为：ATCAACATCAGTCT(SEQIDNO：4)。2、DNA探针的准备：1)、各探针分别溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液中，溶液中单链的浓度利用260nm波长紫外吸收值进行标定；2)、基底链与信号链等摩尔浓度混合，在90℃下保持15分钟，然后再逐渐降温至室温，保持室温进行退火，退火过程超过2小时。获得双链A，在4℃保存；3)、主导燃料链和保护燃料链等摩尔浓度混合，在90℃下保持15分钟，然后再逐渐降温至室温，保持室温进行退火，退火过程超过2小时。获得双链B，在4℃保存；所得双链A浓度为10μM，双链燃料链(双链B)DNA浓度为20μM。3、利用商业转染剂将DNA探针通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内：1)、转染混合液的准备：实验组：将75微升浓度为10μM的双链A，150微升浓度为20μM双链燃料链(双链B)和30微升商业转染剂Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液中，最后补加Tris-HCl缓冲液至总体积300微升，复合20分钟，待用。混合液杂交链浓度为2.5μM，燃料链浓度为10μM。对照组：将75微升双链A，和30微升商业转染剂Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液中，最后补加Tris-HCl缓冲液至总体积300微升，复合20分钟，待用。混合液杂交链浓度为2.5μM，燃料链浓度为10μM。2)、将复合好的DNA探针通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内。3)、将小鼠正常饲养24小时。4、肿瘤组织成像：将安乐死小鼠，解剖小鼠对小鼠器官以及肿瘤组织成像观察，选择被扫描区域，拍摄肿瘤组织图像。结果如图4。对比例11、肿瘤模型的建立：将MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左边腋下(小鼠为母鼠，约4周大小，重约20克)。大约移植2到3周时间可以进行实验。对模型小鼠体内miRNA-21进行检测，基底链序列(从左到右为5'—3')为BHQ-2-CACAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDNO：1)，信号链的序列(从左到右为5'—3')为ATCAGACTGATGTTGATTGTG-Cy5(SEQIDNO：2)，2、DNA探针的准备：1)、各探针分别溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液中，溶液中单链的浓度利用260nm波长紫外吸收值进行标定；2)、基底链与信号链等摩尔浓度混合，在90℃下保持15分钟，然后再逐渐降温至室温，保持室温进行退火，退火过程超过2小时。获得双链A，在4℃保存；所得双链A浓度为10μM。3、利用商业转染剂将DNA探针通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内：1)、转染混合液的准备：将75微升双链A，和30微升商业转染剂Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液中，最后补加Tris-HCl缓冲液至总体积300微升，复合20分钟，待用。混合液杂交链浓度为2.5μM。2)、将复合好的DNA探针通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内。3)、将小鼠正常饲养24小时。4、肿瘤组织成像：将安乐死小鼠，解剖小鼠对小鼠器官以及肿瘤组织成像观察，选择被扫描区域，拍摄肿瘤组织图像。结果如图5。对比例21、肿瘤模型的建立：将MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左边腋下(小鼠为母鼠，约4周大小，重约20克)。大约移植2到3周时间可以进行实验。对模型小鼠体内miRNA-21进行检测，2、利用商业转染剂通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内：1)、转染混合液的准备：将30微升商业转染剂Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)缓冲液中，最后补加Tris-HCl缓冲液至总体积300微升，复合20分钟，待用。2)、将转染混合液通过小鼠尾静脉注射到小鼠体内。3)、将小鼠正常饲养24小时。3、肿瘤组织成像：将安乐死小鼠，解剖小鼠对小鼠器官以及肿瘤组织成像观察，选择被扫描区域，拍摄肿瘤组织图像。结果如图6。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>中国科学技术大学<120>microRNA检测探针组与microRNA的检测方法<130>MP1620839<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>1cacaatcaacatcagtctgataagcta27<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2atcagactgatgttgattgtg21<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3ttatcagactgatgttgattgtg23<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>4atcaacatcagtct14<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>5cacaatcaacatcagtctgataagcta27<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6atcagactgatgttgattgtg21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7tatcagactgatgttgattgtg22<210>8<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>8atcaacatcagtct14<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>9ccaatcaacatcagtctgataagcta26<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10tatcagactgatgttgattgg21<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>11cttatcagactgatgttgattgg23<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>12tcaacatcagtctga15当前第1页1 2 3