本发明涉及生物医学
技术领域：
，具体地说，是涉及一种可用于预示和诊断HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p、该标志物的应用以及诊断试剂盒。
背景技术：
：乳腺癌是世界上女性人口中最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症死亡的最常见原因之一。乳腺癌是一组异质性疾病，包括多种病理类型，每种病理类型均具有不同的组织学表现、不同的生物学行为、不同的临床表现，不同的治疗反应和治疗结果。Perou等首次采用基因微阵列及预后聚类分析技术对乳腺癌标本进行测定，发现不同的乳腺癌基因表型与其临床生物学行为及预后关系密切。根据其遗传和分子图谱，采用表达谱芯片技术可以将浸润性乳腺癌分为5类：分别为LuminalA型(ER和/或PR+、HER-2-、Ki-67<l4％)、LuminalB型(ER和/或PR+、HER-2-、Ki-67≥14％；ER和/或PR+、HER-2+、Ki67任何水平)、HER-2过表达型(ER-、PR-、HER-2+)和三阴型(triple-negativebreastcarcinomas,TNBCs)(ER-、PR-、HER-2-)。其中激素治疗对ER(+)类型有效，曲妥单抗治疗对HER-2过表达型有效。TNBC类型约占乳腺癌发病总数的15％-20％，且因其激素受体位点三联阴性，对抗激素治疗及赫赛汀治疗无效，唯一的治疗方案为系统性化疗。因此4种不同免疫表型的乳腺癌具有相对独立的生物学行为和临床预后，研究各亚型相应的病理特征对于提供新的乳腺癌个体化治疗方法，实现精准医疗具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是长度约18-25nt的非蛋白编码小分子RNA，广泛存在于各种真核细胞生物细胞中。近年来大量研究表明miRNAs对人类肿瘤的发生、发展起着重要的作用，并扮演着致癌基因和抑癌基因的角色。近年研究已经在乳腺癌组织中发现了一系列异常表达的miRNAs。其中miR-126-3p被发现在转移性乳腺癌细胞系中显著低表达，并被证明在抑制肿瘤转移中发挥关键作用。但是，迄今为止缺乏乳腺癌组织学证据表明miR-126-3p在不同免疫表型的乳腺癌中表达是否存在差异。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是能够表达HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p、该标志物在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用及其诊断试剂盒。本申请表明miR-126-3p可以作为特定分子亚型乳腺癌的治疗靶点。为解决上述技术问题，本发明提供了一种HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂盒，包括：MiR-126-3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针、阳性对照U6snRNA的核酸探针、原位杂交缓冲液和蛋白酶K粉末。优选地，所述MiR-126-3p的核酸探针序列如SEQIDNO：1所示。优选地，所述阴性对照Scramble的核酸探针序列如SEQIDNO：2所示。优选地，所述阳性对照U6snRNA的核酸探针序列如SEQIDNO：3所示。本申请还公开了HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p在制备诊断HER-2阳性乳腺癌的诊断试剂中的应用，其特征在于，所述HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p的核酸探针序列如SEQIDNO：1所示。优选地，采用FISH检测方法检测乳腺癌组织中的miR-126-3p含量。优选地，包括步骤：(1)制备MiR-126-3p的核酸探针、阴性对照Scramble的核酸探针和阳性对照U6snRNA的核酸探针；(2)杂交步骤①将组织芯片放入烘箱中，温度调至60-65度，烘蜡1小时；②探针的预处理：准备1×miRNA-ISH缓冲液：10ml2×miRNA-ISH缓冲液和10mlDEPCH2O，将40ul的核酸探针放在无RNA酶的PCR管中，90℃变性4min，放在冰上，快速离心后加入20ml的1×miRNA-ISH缓冲，按1-2ml的体积分装，待使用时直接冻融使用；③缓冲液配制：10×PBS：取40gNaCl，1gKCl，7.2gNa2PO4，1.2gKH2PO4，用HCl调节pH7.4，用DEPC水定容至500ml；1×PBT：取50ml10×PBS和0.5mlTween，用DEPC水定容至500ml；1MTris-HCl，PH7.4：30.475gTris碱，加150mlDEPC水，用浓盐酸调节PH至7.4，用DEPC水定容至250ml；蛋白酶K存储液的配制：用10mMTris-HClPH.7.5稀释蛋白酶K至20mg/ml；顺丁烯二酸缓冲液：0.1M顺丁烯二酸，0.15MNaCl，用NaOH调节PH至7.5；NBT/BCIP稀释液：100ml1M/LTris-HCl，20ml5M/LNaCl，880mlDEPCddH2O，pH9.5；④样本脱蜡：二甲苯3次每次5min，乙醇100％上下浸洗10次，乙醇100％上下浸洗10次乙醇100％5min，乙醇96％上下浸洗10次，乙醇96％5min，乙醇70％上下浸洗10次，乙醇70％5min，PBS2-5min；⑤蛋白酶消化样本：蛋白酶K15ug/mL37℃处理10-30min，PBS2次，简单震摇；⑥酒精脱水：乙醇70％上下浸洗10次乙醇70％1min，乙醇96％上下浸洗10次，乙醇96％1min，乙醇100％上下浸洗10次，乙醇100％1min，放在干净的纸上空气干燥15min；⑦杂交：每张玻片上加50-100ul的杂交液；玻片上盖上22mm×22mm盖玻片，用胶水封片，在杂交温度50℃1h；⑧严格的洗片：用镊子小心的把封片胶撕掉，把玻片放入下面溶液梯度洗片：5×SSC5min杂交温度50℃，1×SSC5min杂交温度50℃，0.2×SSC5min杂交温度50℃，0.2×SSC5min室温，室温，PBS1次×5min；⑨免疫检测：将玻片甩干，在室温湿盒上滴加封闭液，封闭15min；用纸吸干封闭液后，放在湿盒1:800anti-DIG-APFabfragments，4℃过夜；室温，PBST3次×3min；⑩颜色反应和复染封片：避光反应NBT/BCIP30℃显色2h(400ul/玻片)，室温，PBST3次×5min；在水中洗片，2次1min；加200ul核固红染液，10秒-1分钟；将片子在自来水中冲洗10分钟，酒精脱水；用中性树脂封片；(3)原位杂交检测结果判断：通过双盲法独立评估，分别评价其阳性细胞数和染色程度，阳性细胞数评分：未见阳性细胞为0，阳性细胞<5％为1，6％～25％为2，25％～50％为3，51％～75％为4，>75％为5；染色程度评分：未见染色为0，出现浅灰色颗粒为1，出现深灰色为2，出现黑色颗粒为3，总评分结果＝染色阳性细胞数评分×染色程度评分。与现有技术相比，本发明所述的HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p、应用及其诊断试剂盒，达到了如下效果：使用本发明的乳腺癌分子标志物miR-126-3p诊断HER-2阳性乳腺癌具有操作简单，取材方便、安全无创伤、高特异性、高精确性的特点。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为利用miR-126-3p的表达量对HER-2阳性乳腺肿瘤良恶类型诊断的ROC曲线；图2为利用miR-126-3p的表达量对HER-2阳性乳腺癌TNM分期及预后判断的ROC曲线。具体实施方式如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。以下结合附图对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。1、材料：所采用的石蜡组织标本来自湖州市中心医院乳腺病科2009年1月至2015年12月外科手术切除、病理科存档的、组织病理资料和临床病理资料齐全的乳腺癌组织。其中有98例乳腺癌组织经病理诊断证实为乳腺浸润性导管癌，HER-2阳性。收集该98例患者的乳腺癌组织及其配对癌旁组织(距离原发病灶5cm)。均为女性患者，年龄31-74岁，平均年龄48.98岁。患者手术前、手术中均未曾进行过放疗、化疗及免疫治疗等。2、原位杂交检测miR-126-3p的扩增信号(1)探针制备核酸探针设计为5’端和3’端的地高辛双标记，合成自上海生工公司。MiR-126-3p探针序列为：5’-CGCATTATTACTCACGGTACGA-3’；阴性对照Scramble的序列为5’-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3’；阳性对照U6snRNA探针的序列为5’-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3’。(2)杂交步骤①将组织芯片放入烘箱中，温度调至60-65度，烘蜡1小时；②探针的预处理：准备1×miRNA-ISH缓冲液：10ml2×miRNA-ISH缓冲液和10mlDEPCH2O，将40ul的核酸探针放在无RNA酶的PCR管中，90℃变性4min，放在冰上，快速离心后加入20ml的1×miRNA-ISH缓冲，按1-2ml的体积分装，待使用时直接冻融使用；③缓冲液配制：10×PBS：取40gNaCl，1gKCl，7.2gNa2PO4，1.2gKH2PO4，用HCl调节pH7.4，用DEPC水定容至500ml；1×PBT：取50ml10×PBS和0.5mlTween，用DEPC水定容至500ml；1MTris-HCl，PH7.4：30.475gTris碱，加150mlDEPC水，用浓盐酸调节PH至7.4，用DEPC水定容至250ml；蛋白酶K存储液的配制：用10mMTris-HClPH.7.5稀释蛋白酶K至20mg/ml；顺丁烯二酸缓冲液：0.1M顺丁烯二酸，0.15MNaCl，用NaOH调节PH至7.5；NBT/BCIP稀释液：100ml1M/LTris-HCl，20ml5M/LNaCl，880mlDEPCddH2O，pH9.5；④样本脱蜡：二甲苯3次每次5min，乙醇100％上下浸洗10次，乙醇100％上下浸洗10次乙醇100％5min，乙醇96％上下浸洗10次，乙醇96％5min，乙醇70％上下浸洗10次，乙醇70％5min，PBS2-5min；⑤蛋白酶消化样本：蛋白酶K15ug/mL37℃处理10-30min，PBS2次，简单震摇；⑥酒精脱水：乙醇70％上下浸洗10次乙醇70％1min，乙醇96％上下浸洗10次，乙醇96％1min，乙醇100％上下浸洗10次，乙醇100％1min，放在干净的纸上空气干燥15min；⑦杂交：每张玻片上加50-100ul的杂交液；玻片上盖上22mm×22mm盖玻片，用胶水封片，在杂交温度50℃1h；⑧严格的洗片：用镊子小心的把封片胶撕掉，把玻片放入下面溶液梯度洗片：5×SSC5min杂交温度50℃，1×SSC5min杂交温度50℃，0.2×SSC5min杂交温度50℃，0.2×SSC5min室温，室温，PBS1次×5min；⑨免疫检测：将玻片甩干，在室温湿盒上滴加封闭液，封闭15min；用纸吸干封闭液后，放在湿盒1:800anti-DIG-APFabfragments，4℃过夜；室温，PBST3次×3min；⑩颜色反应和复染封片：避光反应NBT/BCIP30℃显色2h(400ul/玻片)，室温，PBST3次×5min；在水中洗片，2次1min；加200ul核固红染液，10秒-1分钟；将片子在自来水中冲洗10分钟，酒精脱水；用中性树脂封片；(3)原位杂交检测结果判断：通过双盲法独立评估，分别评价其阳性细胞数和染色程度，阳性细胞数评分：未见阳性细胞为0，阳性细胞<5％为1，6％～25％为2，25％～50％为3，51％～75％为4，>75％为5；染色程度评分：未见染色为0，出现浅灰色颗粒为1，出现深灰色为2，出现黑色颗粒为3，总评分结果＝染色阳性细胞数评分×染色程度评分。结果98例乳腺癌组织及其配对癌旁组织的miR-126-3p的表达结果见表4。miR-126-3p在98例癌组织中的表达量为6.02±2.713，在其配对的98例癌旁组织中的表达量为3.19±1.448，两组具有显著性差异(t＝9.321，p<0.001)，说明miR-126-3p在癌组织中的表达量显著高于非癌组织，可以作为判断肿瘤良恶的评价指标。表1为miR-126-3p在乳腺癌组织中的表达量与淋巴结转移和TNM分期之间的相关性：miR-126-3p在出现淋巴结转移的乳腺癌组织中的表达量(6.66±2.700)高于未出现淋巴结转移的乳腺癌组织(5.35±2.589)，且两组之间差异有统计学意义(t＝2.442，p＝0.016)；miR-126-3p在TNM分期为I-II期的乳腺癌组织中的表达量(5.44±2.536)低于TNM分期为III-IV期的乳腺癌组织中的表达量(6.83±2.774)且两组之间差异有统计学意义(t＝2.575，p＝0.012)。此外，我们进一步评价了miR-126-3p表达量与年龄和肿瘤大小之间的相关性，结果显示，miR-126-3p表达量与年龄的相关系数为0.106(p＝0.301)，与肿瘤大小的相关系数为0.158(p＝0.120)。以上结果显示miR-126-3p的表达量在出现淋巴结转移和TNM分期更高的组织中增加，与年龄和肿瘤大小无关，说明miR-126-3p的表达量与HER-2阳性乳腺癌的恶性程度密切相关，miR-126-3p在HER-2阳性乳腺癌组织中的高表达具有明确提示预后不良的临床作用。表1：miR-126-3p在乳腺癌组织中的表达量与淋巴结转移和TNM分期之间的相关性参数例数miR-126-3pt/p值淋巴结转移有506.66±2.700t＝2.442无485.35±2.589p＝0.016TNM分期I-II575.44±2.536t＝2.575III-IV416.83±2.774p＝0.012为进一步评价miR-126-3p的表达量对肿瘤良性和恶性的诊断价值及对肿瘤浸润深度、恶性程度的预警作用，我们采用诊断特征曲线(ROC)分析分别评价了miR-126-3p在区分癌组织和癌旁组织、高TNM分期(III-IV)和低TNM分期(I-II)中的诊断价值。该方法的基本原理是：通过诊断界点(cutoffpoint/cutoffvalue)的移动，获得多对灵敏度(sensitivity)和误诊率(1-特异度specificity)，以灵敏度无纵轴，以误诊率为横轴，连接各点绘制曲线，然后计算曲线下的面积(AUC)，面积越大，诊断价值越高。图1为用ROC分析评价miR-126-3p的表达量对HER-2阳性乳腺肿瘤良恶类型的诊断价值。ROC曲线下面积为0.809，面积的标准误为0.031，miR-126-3p的表达量用于判断肿瘤的良性和恶性程度具有显著意义(P＝0.000)，miR-126-3p的表达量越高，肿瘤恶性程度越强。面积的可信区间为(0.748,0.871)不包括0.5，得出相同的结论。根据ROC曲线各点所对应的灵敏度和误诊率(1-特异度)，见表2，选择灵敏度-误诊率的最大值(0.551)对应的miR-126-3p的表达量值(4.5)为诊断界点值，即cutoff值。表2利用miR-126-3p的表达量对HER-2阳性乳腺肿瘤良恶类型诊断的ROC曲线的坐标图2为用ROC分析评价miR-126-3p的表达量对HER-2阳性乳腺癌TNM分期程度及预后判断的诊断价值。ROC曲线下面积为0.650，面积的标准误为0.057，miR-126-3p的表达量用于判断恶性肿瘤的浸润程度具有显著意义(p＝0.011)，miR-126-3p的表达量越高，肿瘤的浸润程度越高，TNM分期越高，预后越差。面积的可信区间为(0.539,0.761)不包括0.5，得出相同的结论。根据ROC曲线各点所对应的灵敏度和误诊率(1-特异度)，见表3，选择灵敏度-误诊率的最大值(0.225)对应的miR-126-3p的表达量值(7.0)为诊断界点值，即cutoff值。表3利用miR-126-3p的表达量对HER-2阳性乳腺癌TNM分期及预后判断的ROC曲线的坐标根据以上较大规模临床验证实验数据，开发适用于HER-2阳性乳腺癌患者的诊断试剂盒，该试剂盒能检测患者的肿瘤组织是否表达过量的miR-126-3p(cutoff值为4.5)，提示患者可以采用相应的拮抗miR-126-3p的药物进行治疗，miR-126-3p值越高(cutoff值为7.0)提示肿瘤患者TNM分期越高，预后越差。该试剂盒包括：MiR-126-3p核酸探针，阴性对照Scramble核酸探针，阳性对照U6snRNA探针，原位杂交缓冲液，蛋白酶K粉末。试剂盒使用方法参见杂交步骤。表498例乳腺癌组织及其配对癌旁组织的miR-126-3p的表达结果上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。SEQUENCELISTING<110>湖州市中心医院<120>HER-2阳性乳腺癌组织的标志物miR-126-3p、应用及其诊断试剂盒<130>160033<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1cgcattattactcacggtacga22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gtgtaacacgtctatacgccca22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3cacgaatttgcgtgtcatcctt22当前第1页1 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